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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准!!#!#!#$#裂谷热检疫技术规范$%&’&()*(+,’-)-.-/0-’’*0)1&//+20+1+’!#$#3$$3#$发布!#$$3#%3#$实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：鱼海琼、鄢志强、林志雄、罗长保、林祥梅、韩雪清、罗琼、田纯见、梁刚。Ⅰ犛犖／犜２７０７—２０１０裂谷热检疫技术规范１ 范围本标准规定了裂谷热病毒分离鉴定技术、微量血清中和试验方法、酶联免疫吸附试验方法和血凝抑制试验方法的技术要求。本标准适用于裂谷热的检疫。２ 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ１８０８８ 出入境动物检疫采样ＧＢ１９４８９ 实验室 生物安全通用要求３ 缩略语下列缩略语适用于本文件。ＢＨＫ：仓鼠肾细胞ＣＥＲ：鸡胚网状组织细胞ＣＰＥ：细胞病变ＯＤ：光密度ＰＢＳ：磷酸盐缓冲液ＲＮＡ：核糖核酸ＲＶＦ：裂谷热ＴＣＩＤ５０：组织培养半数感染量Ｖｅｒｏ：非洲绿猴肾细胞４ 临床诊断根据裂谷热临床症状和发病机理（参见附录Ａ）做出初步诊断，确诊还需进行实验室诊断。５ 实验室诊断警告：涉及传染性材料和病毒的部分要严格按照犌犅１９４８９的要求操作。５．１ 病毒分离和鉴定５．１．１ 材料５．１．１．１ 荧光显微镜。５．１．１．２ 二氧化碳培养箱。１犛犖／犜２７０７—２０１０５．１．１．３ ２５ｃｍ２细胞培养瓶，９６孔平底细胞培养板，带盖湿盒。５．１．１．４ 无ＲＶＦ抗体胎牛血清，细胞分散液。５．１．１．５ ＲＶＦ标准毒株和标准阳性、阴性血清，ＲＶＦ荧光抗体。５．１．１．６ Ｖｅｒｏ细胞或ＢＨＫ细胞或ＣＥＲ细胞。５．１．１．７ 溶液及细胞培养液配制见附录Ｂ。５．１．２ 样品的采集按ＧＢ／Ｔ１８０８８规定，逐头进行采样，并按规定填写《送样单》送实验室。采集发热期动物的抗凝血５ｍＬ。对怀疑死于该病的动物采集死亡动物的肝脏、脾脏、大脑，流产胎儿５ｇ。５．１．３ 样品的处理血液用常规方法分离血清。死亡动物的肝脏、脾脏、大脑，流产胎儿经剪碎、研磨，加生理盐水，冻融两次，４℃过夜，离心取澄清样品上清液。５．１．４ 样品的培养取生长良好，形成８０％以上单层的细胞，倒去培养液，接种处理好的样品，每瓶接种１ｍＬ，每个样品接种３个细胞瓶。置３７℃二氧化碳培养箱吸附２ｈ。倒去样品，加入维持液，３７℃二氧化碳培养箱培养６ｄ。收获病毒，同一样品３瓶混和，冻融两次后进行下一步鉴定。５．１．５ 样品培养物的鉴定将生长良好的细胞，用细胞分散液处理后，制备成２×１０５个／ｍＬ的细胞悬液，加入到９６孔细胞培养板内，每孔０．１ｍＬ，置３７℃培养。等细胞生长成８０％的单层，吸出孔内培养液，接种样品培养物，每孔０．１ｍＬ，每个样品４个孔。阴性、阳性和空白细胞对照方法同待检样品培养物，每个对照２个孔。置３７℃二氧化碳培养箱吸附２ｈ。吸出各孔内的所加的待检和对照样品，加入维持液，每孔０．１ｍＬ，置３７℃二氧化碳培养箱培养３ｄ。取出细胞板，用ＰＢＳ漂洗，自然干燥后，用－２０℃预冷的丙酮固定１５ｍｉｎ，用ＰＢＳ洗３次，自然干燥。滴加ＲＶＦ阳性血清，置３７℃作用１ｈ。滴加适量免疫荧光抗体，放进湿盒，３７℃作用２ｈ。用ＰＢＳ洗３次，倾去液体。荧光显微镜镜检。５．１．６ 结果判定结果判定如下：———阳性对照在显微镜下胞浆呈黄绿色，并见有黄绿色荧光的细小颗粒散布于胞浆内；———阴性对照、空白对照无荧光；———没有经过阳性抗体作用的细胞荧光较亮，形态清晰，而经过阳性抗体抑制的同一样品无荧光，则判为阳性；２犛犖／犜２７０７—２０１０———没有经过阳性抗体作用的细胞荧光微弱，形态不清晰，经过阳性抗体抑制的同一样品无荧光，则重检；重检后仍荧光微弱，形态不清晰，则判为阳性，重检后无荧光则判为阴性；———如果阳性对照无特异性荧光或阴性对照出现特异性荧光，则试验失败，应该重检。５．２ 微量血清中和试验５．２．１ 材料５．２．１．１ 溶液及细胞培养液配制见附录Ｂ。本方法使用的阳性血清、阴性血清和被检血清应经过５６℃３０ｍｉｎ灭活处理。５．２．１．２ ＲＶＦ标准毒株和标准阳性、阴性血清。５．２．１．３ Ｖｅｒｏ细胞或ＢＨＫ细胞或ＣＥＲ细胞。５．２．１．４ 无ＲＶＦ抗体胎牛血清，细胞分散液。５．２．１．５ ２５ｃｍ２标准细胞培养瓶，９６孔无菌细胞培养板，５０μＬ、１００μＬ微量可调移液器。５．２．１．６ 倒置光学显微镜。５．２．１．７ 二氧化碳培养箱。５．２．２ 种毒繁殖将ＲＶＦ标准毒用维持液作１０倍稀释，取长成良好单层的细胞，用ＰＢＳ洗一次后，接种１ｍＬ病毒，置３７℃作用６０ｍｉｎ，加入维持液，置３７℃二氧化碳培养箱培养至８０％细胞出现病变，收获病毒，冻融两次或者超声波裂解，３０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液，测定病毒ＴＣＩＤ５０并分装小瓶，置－７０℃冰箱保存备用。５．２．３ 病毒的毒价测定将制备的标准病毒抗原，用维持液将其作１０倍递增稀释至１０－８，每个滴度接种细胞培养板８个孔，每孔５０μＬ，随后每孔加入细胞悬液（３×１０５个／ｍＬ）１００μＬ和细胞维持液５０μＬ。同时每板设８孔细胞对照。置３７℃二氧化碳培养箱，逐日观察至６ｄ，记录细胞病变，按Ｋｒｂｅｒ法或Ｒｅｅｄｍｕｅｎｃｈ法计算ＴＣＩＤ５０／５０μＬ。５．２．４ 中和试验操作程序５．２．４．１ 血清稀释所有被检血清按要求稀释，每份血清在９６孔细胞培养板上做双份，每孔加５０μＬ。阴、阳性对照血清一般稀释８个稀释度：１∶２～１∶２５６，举例：从Ａ１至Ｈ１共８孔各加５０μＬ稀释液，吸取５０μＬ阳性对照血清加至Ａ１孔，吸吹均匀，移５０μＬ至Ｂ１孔，依此类推，直到Ｈ１孔。阴性对照血清同样。５．２．４．２ 工作病毒滴度确认试验病毒工作浓度为１００ＴＣＩＤ５０，按照毒价测定结果确定稀释比例稀释病毒，工作用病毒滴度确认试验是将工作病毒稀释成１０－１、１０－２、１０－３，每一稀释度各８孔。５．２．４．３ 中和试验吸取病毒工作液５０μＬ至Ａ２、Ａ３、Ａ４孔，其他被检血清孔同样各加５０μＬ。３７℃中和１ｈ，各孔加入适当的细胞悬液１００μＬ（细胞量为３×１０５个／ｍＬ），用封口纸或胶布封口，将细胞板置３７℃二氧化碳培养箱培养，并在培养３ｄ～６ｄ后观察ＣＰＥ。３犛犖／犜２７０７—２０１０５．２．５ 结果判定按照病毒滴度确认试验判断病毒的试验剂量，１００ＴＣＩＤ５０～３００ＴＣＩＤ５０范围内为合理。同时阴性血清对照出现典型细胞病变，阳性血清对照无细胞病变，被检血清对细胞无毒性，细胞对照正常，证明试验成立，可以进行结果判定，否则，试验不成立，复检。判定标准为被检血清同一稀释度５０％的孔出现完全保护则判为阳性，１００％的孔出现细胞病变时判为阴性。５．３ 间接酶联免疫吸附试验５．３．１ 材料５．３．１．１ 溶液配置见附录Ｂ。５．３．１．２ ＲＶＦ标准毒株、标准阳性、阴性血清、无ＲＶＦ抗体胎牛血清和辣根过氧化酶标记的ＩｇＧ及细胞培养液。５．３．１．３ Ｖｅｒｏ细胞或ＢＨＫ细胞或ＣＥＲ细胞。５．３．１．４ 无菌采血，分离血清编号后备用。５．３．１．５ ２５ｃｍ２标准细胞培养瓶，９６孔酶标反应板，微量可调移液器（２０μＬ～２００μＬ）、移液器吸头。５．３．１．６ 酶标仪、二氧化碳培养箱。５．３．２ 抗原扩增用ＲＶＦ毒株接种Ｖｅｒｏ细胞或ＢＨＫ细胞或ＣＥＲ细胞，加无血清培养基３７℃孵育２４ｈ，刮下并离心细胞，弃去上清液，用差速离心法或密度梯度离心法纯化病毒作为抗原，小瓶分装，－７０℃或冻干保存。或直接使用基因表达产物。非感染细胞用同样方法处理，制备对照抗原。５．３．３ 试验程序５．３．３．１ 抗原的包被和封闭用包被缓冲液将抗原稀释至工作浓度后，加入酶标板孔内，每孔５０μＬ。将酶标板置于湿盒内于室温（２０℃～２５℃）过夜。５．３．３．２ 洗板弃去孔内溶液，用ＰＢＳＴ洗板３次，拍干。５．３．３．３ 加样加入已经稀释的被检血清。每样加２孔，每孔５０μＬ。同时设空白（加５０μＬ，样品稀释液）、阴性血清、强阳性血清和弱阳性血清对照。混匀，３７℃作用１ｈ。５．３．３．４ 洗板用ＰＢＳＴ洗板５次，拍干。５．３．３．５ 加酶标物加入工作浓度的辣根过氧化酶标记的ＩｇＧ，每孔５０μＬ。混匀，３７℃作用１ｈ。５．３．３．６ 洗板用ＰＢＳＴ洗板５次，拍干。４犛犖／犜２７０７—２０１０５．３．３．７ 加底物每孔加入底物溶液１００μＬ。混匀，置３７℃，避光作用１０ｍｉｎ。５．３．３．８ 加终止液每孔加入终止液１００μＬ。５．３．３．９ 测定犗犇值于相应波长读取ＯＤ值。５．３．３．１０ 结果判定阴、阳性对照均成立时，用统计学方法计算得阳性血清、阴性血清临界值，根据所测得的样品ＯＤ值判定结果，ＯＤ值大于或等于阳性血清临界值即判为阳性，ＯＤ值小于或等于阴性血清临界值即判为阴性。介于其间则为可疑。５．４ 血凝抑制试验５．４．１ 试验材料５．４．１．１ ＲＶＦ病毒抗原。５．４．１．２ 阴、阳性对照血清。５．４．１．３ 无菌采集鹅血液５ｍＬ～１０ｍＬ，加入等量阿氏液（见附录Ｂ）中摇匀，置４℃冰箱中保存备用。临用前，洗涤３次～５次，每次３０００ｒ／ｍｉｎ，将血浆、白细胞充分洗去至上清液清亮，再将沉淀的红细胞稀释成１％的红细胞悬浮液。５．４．１．４ 无菌采集被检动物血液，离心分离血清，５６℃灭活３０ｍｉｎ。５．４．１．５ 灭菌的生理盐水（见附录Ｂ）。５．４．１．６ Ｖ型９６孔微量滴定板，微量加样器。５．４．２ 试验操作５．４．２．１ 抗原血凝效价的测定取干净的微量滴定板一块，按表Ｂ．１进行操作。每孔加２５μＬ生理盐水，孔１加抗原２５μＬ，用移液器反复吹打混匀３次。吸出２５μＬ于孔２，吹打混匀后吸出２５μＬ于孔３，如此依次稀释到孔１０，孔１０混匀后吸出２５μＬ弃掉。抗原稀释完后，每孔补加生理盐水２５μＬ。孔１１、１２不加抗原，每孔只加生理盐水作空白对照每孔加入１％的红细胞悬浮液２５μＬ，充分振荡后置于室温，每５ｍｉｎ观察一次，１５ｍｉｎ～３０ｍｉｎ后判定结果，并作好记录。抗原的血凝滴度是指能使１％红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍数。因此，能使红细胞完全凝集的最高稀释倍数的病毒液２５μＬ称为１个血凝单位（ＨＡ）。如某抗原的血凝滴度是１∶１２８，那么１∶１２８稀释的该抗原２５μＬ即为１个ＨＡ单位。在进行血凝抑制试验时，病毒的工作浓度应为８ＨＡ。那么该病毒的工作浓度为１∶１６，那么２５μＬ１∶１６的抗原即含８个ＨＡ单位。５．４．２．２ 血凝抑制试验５．４．２．２．１ 加生理盐水取干净的微量滴定板一块，按表Ｂ．２进行操作。５犛犖／犜２７０７—２０１０每孔加２５μＬ生理盐水。５．４．２．２．２ 加待检血清孔１加待检血清２５μＬ，用移液器反复吹打混匀三次；吸出２５μＬ于孔２，吹打混匀后吸出２５μＬ于孔３，如此依次稀释到孔８。孔８混匀后吸出２５μＬ弃掉。５．４．２．２．３ 加对照孔９作为阳性血清对照，孔１０作为阴性血清对照，孔１１不加任何血清而作为抗原对照，孔１２不加抗原和任何血清，只加生理盐水作空白对照。５．４．２．２．４ 加红细胞悬浮液各孔加入１％红细胞悬浮液２５μＬ，充分振荡后置室温，每５ｍｉｎ观察一次。未免疫的健康动物血清无凝集抑制作用，各稀释倍数均出现红细胞凝集现象；感染或免疫的动物血清能抑制病毒对红细胞的凝集抑制作用。凡能使抗原凝集红细胞作用完全被抑制的血清最高稀释倍数，称为该血清的血凝抑制价（如附录Ｂ的血凝抑制价为１∶３２）。５．４．２．２．５ 结果判定结果判定如下：———判定时应首先观察各对照孔是否完全成立；———红细胞凝集：红细胞分散在孔底四周呈均匀的颗粒状凝集且布满整个孔底，判为血凝作用为阳性“＋”；———无凝集或凝集抑制：红细胞集中于孔底中央呈点