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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准!!#!#$!#%#鱼淋巴囊肿病检疫技术规范$%&’&()*(+,’-)-.-/0-’/12,3-.14)*45*4+&4+!#%#6%%6#%发布!#%%6#&6#%实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前!!言!!本标准按照!!#$%$&’’(给出的规则起草#本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口#本标准起草单位$中华人民共和国广东出入境检验检疫局#本标准主要起草人$邱杨%刘建丽%赵丽#!!!#!#$!#%#鱼淋巴囊肿病检疫技术规范%!范围本标准规定了在临床症状的基础上&用显微镜检测鱼淋巴囊肿病的方法#本标准适用于鱼淋巴囊肿病的检疫#!!规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的#凡是注日期的引用文件&仅注日期的版本适用于本文件#凡是不注日期的引用文件&其最新版本’包括所有的修改单(适用于本文件#!!#))*&!分析实验室用水规格和试验方法&!缩略语下列缩略语适用于本文件#+,-.’/01234506786986:;6:($淋巴囊肿病毒’!试剂和材料’%%!水$符合!!#))*&中一级水的规格#’%!!-;8964=氏固定液’见附录%$(#’%&!苏木精染色剂#’%’!伊红染色剂#(!器材和设备(%%!切片机#(%!!显微镜#$!鱼淋巴囊肿病临床诊断和显微镜检查$%%!临床症状鱼淋巴囊肿病是一种鱼的体表病’参见附录(&病鱼体表皮肤%鳍%鳃和口部出现多个大小不等的囊肿’参见图,%$(&以背鳍%腹鳍基部最为严重&似珍珠样&单在或成群#病变部位呈灰白色或灰黄色&有时带有出血而呈淡红色&并常融合而成桑葚样#囊肿的质地柔软&肉眼可见囊肿内有许多的小颗粒#体表%鳃%颌部及肛门等多处有出血点&剖检有时可见在鳃丝%咽部有肿胀物&有的肝脏切口边缘外翻&提示肝肿大#$%!!显微镜检查取体表囊肿组织&用-;8964=氏固定液进行固定#固定好的组织块用水充分洗涤&按下列程序处$!!#!#$!#%#理制作组织切片&依次浸入如下试剂$?’@乙醇)’18=&*A@乙醇)’18=&(A@乙醇)’18=&无水乙醇!B’18=&无水乙醇B’18=&二甲苯C无水乙醇’体积比$D$(B’18=&二甲苯!B’18=&二甲苯B’18=&二甲苯C石蜡’体积比$D$($A18=&石蜡!$A18=&石蜡$A18=’根据组织块大小和种类&各步时间作适当调整(#石蜡包埋后&进行切片#切片厚度不超过)#1#经苏木精E伊红染色’见附录%&(后&进行光学显微镜观察#发现原先肉眼可见囊肿内的许多小颗粒镜下为巨大细胞’参见图,%&(&直径可达$’’#1$A’’#1&体积是正常细胞的数万倍&有很厚的细胞膜#细胞核偏离中心位置#细胞质内散布有大量大小不一的网状的包涵体#这种包涵体呈楔状%块状&或数个成链圈状排列&且大多集中在细胞的边缘部分#!鱼淋巴囊肿病综合判定由于该病有其特异性的临床症状&有囊肿判为可疑#然后通过组织切片观察巨大细胞来确诊#通常不需要其他的检测手段&很容易和其他体表疾病区别开来&如$痘疮病和水霉病等#患痘疮病的鱼体表出现粘稠的石蜡状的白色增生物&即痘疮&痘疮里不含网状包涵体的巨大细胞#而患水霉病的鱼其体表覆盖的丝状或絮状物&镜检是能观察到霉菌丝#&!!#!#$!#%#附!录!$’规范性附录(试剂配制及染色方法$%%!%&’()*+,氏固定液配制B?@甲醛!!!!!!!!!!&&’1+(A@乙醇BB’1+冰乙酸$$A1+蒸馏水BBA1+$%!!苏木精-伊红染色方法$%!%%!配制苏木精!!!!!!!!!!!$F氧化汞’%AF乙醇$’1+硫酸铝钾’或硫酸铝铵(&’F去离子水&’’1+在酒精内溶解苏木精&在水内溶解硫酸铝钾&加热助溶#混合苏木精和硫酸铝钾溶液&尽快煮沸#加入氧化汞&此时溶液变成深紫色#在自来水中迅速冷却&滤纸过滤&装入瓶中盖紧&室温保存#$%!%!!染色$%!%!%%!脱蜡$依次浸入如下试剂$二甲苯A18=&二甲苯C无水乙醇’体积比$D$(A18=&$’’@乙醇&18=&(A@乙醇$18=&*’@乙醇$18=&?A@乙醇$18=&蒸馏水洗&18=#$%!%!%!!用苏木精染色$’18=#$%!%!%&!在稀释的氨水中分化&直至呈蓝色’约$’18=(#$%!%!%’!用’%A@伊红复染&6$A6#$%!%!%(!脱水$依次浸入如下试剂$(A@乙醇’!($18=&(A@乙醇’($18=&$’’@乙醇’!($18=&$’’@乙醇’($18=#$%!%!%$!透明$依次浸入如下试剂$二甲苯石碳酸’BD$($18=&二甲苯$18=&二甲苯C无水乙醇’体积比$D$($18=#$%!%!%!中性树胶封片#注$此法用于观察细胞在体外感染后的一般形态#显示细胞的变化&融合细胞形成及细胞内包涵体#嗜酸性包涵体染色呈亮红色#B!!#!#$!#%#附!录!.’资料性附录(鱼淋巴囊肿病概述!!鱼淋巴囊肿病是一种常见于鱼类皮肤和鳍上的良性肿瘤样病&广泛发生于全世界的海水鱼和淡水鱼类&如鲱科’,/82:89;:(%脂科’G:HH;=89;:(%鲈科’I:H589;:(%虾虎科’!4J89;:(等均可患病#近年来由于高密度养殖的推广&特别是越冬养殖时的加温和密集养殖&往往导致疾病爆发并引起大量死亡#而在一般情况下死亡率并不是很高&但会因体表上布满囊肿而丧失其经济价值#该病的病原是病毒&即淋巴囊肿病毒’+,-.(&属于虹彩病毒科&淋巴囊肿病毒属#该病毒的衣壳外形呈六角形&直径约为&’’=1$&)’=1&核心的直径约$A’=1&衣壳厚度约$&=1&外有囊膜#鱼淋巴囊肿病毒含双链-K&基因组全长为$’’LJ$$*’LJ&至少存在三个基因型$!:=:702:!唯一种+,-.E!)!:=:702:包括有从日本牙鲆中分离的+,-.E,等*个株)!:=:702:%平分离株等B个株&可以用不同引物的I,M把它们相互区分开#患病鱼的体表包括鳍条和口部出现多个大小不等的囊肿&似珍珠样&单在或成群#病变部位呈灰白色或灰黄色&有时带有出血而呈淡红色&并常融合而成桑葚样&严重时会遍布全身#肉眼可见囊肿内有许多的小颗粒#经接触感染或者当囊肿破溃时&病毒逸出于水中可能引起新的感染#鳃等是病毒的主要入口&没有证据显示可以垂直传播#淋巴囊肿病的监床症状和病理变化十分特殊&不需要分离病毒和进行血清学检测&做组织病理切片检查即可确诊#在淋巴囊肿的切片中&镜下清楚可见囊肿内有巨大细胞&直径可达$’’#1$A’’#1&有一个偏心的核&并有大量的网状包涵体&散布于胞浆内&特别是其边缘部分#通常&没有体表临床症状的鱼不需做淋巴囊肿病毒的检测#N!!#!#$!#%#附!录!/’资料性附录(临床症状和病理切片图/%%!感染淋巴囊肿的鱼的临床症状图/%!!组织病理切片A!!#!#$!#%#