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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准!!#!#$!%&%牛胎儿毛滴虫检验方法$%&’&(&)&*+,’,(’-&.*&%!#$#%&’(’)*+,-$.+-./&0-.,!%&%1&&1%&发布!%&&1%’1%&实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前!!言!!本标准按照!!#$%$&’’(给出的规则起草#本标准修改采用了)*+$哺乳动物%禽%蜜蜂,和类疾病诊断试验和疫苗标准手册&’&’’-版(的有关章节)参照了加拿大动物疾病研究所的操作规程#本标准由认证认可监督管理委员会提出并归口#本标准起草单位*中华人民共和国天津出入境检验检疫局#本标准主要起草人*张立怀%王建华%陈本龙%霍蕾%侯艳梅#!!!#!#$!%&%牛胎儿毛滴虫检验方法&!范围本标准规定了牛胎儿毛滴虫的病原鉴定和./0检测方法#本标准适用于进出口牛%牛精液中胎儿毛滴虫的检疫#也适用于牛场胎儿毛滴虫病的监测#!!规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的#凡是注日期的引用文件)仅注日期的版本适用于本文件#凡是不注日期的引用文件)其最新版本’包括所有的修改单(适用于本文件#!!#--1&!分析实验室用水规格和试验方法’!概述胎儿毛滴虫’!#$#%&’(’)*+,-$.+(引起牛生殖道毛滴虫病)造成奶牛流产和不育#牛是胎儿毛滴虫的自然宿主)猪%马%獐也可能是它的自然宿主#在肉牛群中)或在人工授精技术尚未广泛应用的地方)该病仍然十分严重#该病是世界动物卫生组织规定的二类病#该病原体有三个血清型)分别是贝尔法斯特型%曼利型和布里斯班型)都具有同等的致病力)该病主要经交媾传播)也能通过人工授精或产科检查传播#$!设备与器材$%&!采样管和吸球)采样管为中空的塑料长管)采样端钝)另一端可与吸球相连#$%!!剪刀%记号笔%一次性手套%防护服%吸水纸%桶%消毒液#$%’!生物安全柜#$%$!培养箱#$%(!普通生物显微镜#$%!台式离心机#$%)!基因扩增仪#$%*!水浴锅#$%#!涡旋振荡器#$%&%!冰箱#$%&&!琼脂糖凝胶电泳仪#$%&!!凝胶成像分析系统#(!培养基及试剂除特殊说明外)试验用水应符合!!#--1&规定#(%&!胎儿毛滴虫运输培养基’#2#3(’见附录,%$(#(%!!胎儿毛滴虫培养基*456789:培养基’见附录,%&(#(%’!吉姆萨染液’见附录,%;(#$!!#!#$!%&%(%$!裂解液’见附录,%(#(%(!酚!三氯甲烷!异戊醇&=&$#(%!;78?!@乙酸钠’见附录,%=(#(%)!#+缓冲液#(%*!阳性对照*由指定单位供应#!样品采集%&!公牛的阴茎包皮清洗液的采集公牛用六柱栏保定)用绳子固定采样侧的后肢)剪短阴筒外面的阴毛)用清水洗净公牛的尿道口)并用纸擦干#将采样管的采样端插入阴筒内)将另一端的吸球压扁)用$’7@预热至;=A左右的生理盐水反复冲洗)吸取冲洗液#取出采样管)迅速将冲洗液注入无菌$=7@离心管中#将采样管放入消毒液中#冲洗液静置$=759&’759)用一次性吸管吸取底部液体$7@)分别注入两瓶#2#3中)’%=7@!瓶#$1A;BA条件下)尽快送至实验室#%!!母牛的生殖道清洗液%阴道粘液的采集母牛六柱栏保定)用清水洗净牛的外阴部)将采样管的采样端插入阴道内)用$’7@预热至;=A左右的生理盐水冲洗)将另一端的吸球压扁并来回抽动)吸取阴道粘液#取出采样管)迅速将冲洗液注入无菌$=7@离心管中#将采样管放入消毒液中#冲洗液静置$=759&’759)用一次性吸管吸取底部液体$7@)分别注入两瓶#2#3中)’%=7@!瓶#$1A;BA条件下)尽快送至实验室#%’!流产的胎儿样品采集无菌采取胎儿的胃内容物$7@)’%=7@!瓶)分别注入两瓶#2#3中)$1A;BA条件下)尽快送至实验室#%$!精液的采集人工采集的新鲜或冷冻精液)取$7@置&瓶#2#3中)’%=7@!瓶#尽快送至实验室#)!虫体的培养与镜检)%&!样品送至实验室后)立即对样品进行离心)&=’’C!759)离心$’759)不弃上清液)无菌从管底取$滴&滴沉淀物至载玻片上)不盖盖玻片)$’D镜下观察#)%!!如未发现虫体)另取&滴;滴沉淀物接种到含$’7@456789:培养基的试管中#接种时)应将沉淀物接种在培养液的上层近液面处#;BA培养B:#)%’!分别在第&%%=%B天从管底部取一滴检查#检查方法同B%$#)%$!发现虫体后)推荐用吉姆萨染液染色后观察#将待检样品取一滴)置于载玻片一端)用另一片载玻片推成薄膜)室温下干燥)用甲醇固定&759)将载玻片浸入含吉姆萨染色液的染色缸中)染色;’759#取出后)吸干多余染液)在’D倍物镜下观察#*!虫体的鉴定*%&!形态学鉴定胎儿毛滴虫是一种有鞭毛%呈梨状的真核原生动物#具有三根前鞭毛%一根后鞭毛和波动膜)体长约1#7$1#7%宽#7(#7)呈活泼的蛇形运动#虫体前半部有核)有$个不易观察到的胞质体&!!#!#$!%&%和副基体#有鞭毛根);根向前游离与体长相等+$根向后沿波动膜延伸)出虫体后成游离鞭毛#波动膜有;个-个弯曲#虫体中央有一条纵走的轴柱)起始于虫体前端)沿体中线向后延伸)其末端突出于体后端#虫前端与波动膜相对的一侧有半月状胞口’参见附录(#*%!!$%&鉴定*%!%&!引物序列胎儿毛滴虫扩增引物序列见表$#表&!胎儿毛滴虫扩增引物序列靶基因名称序列号引物序列扩增片段大小!EF=%1GC0H,基因#20;=,I/!!!#/##//#,#,#!,!,/,!,,//I;,#20=,I//#!//!##!!,#/,!###/!##,,I;,;B*%!%!!虫体’(的制备取可疑虫体样品=’’#@);’’’C!759离心=759)弃上清液#将沉淀用$’’#@.G重新悬浮#加$’’#@细胞裂解液)在涡旋振荡器上振荡$’J混匀)$&’’’C!759离心=759)取上清液)用等体积的&=&$的酚!三氯甲烷!异戊醇抽提样本#取上层水相到新离心管中#加等量冰冻异丙醇和’%$倍体积的;778?!@乙酸钠)置K&’A&L或过夜)沉淀4H,#$&’’’C!759A离心$’759)倒掉上清液)加1’’#@B’M乙醇)颠倒洗涤)$’’’’C!759A离心$’759)倒掉上清液)空气中干燥$’759)加$’#@#+)备用#取标准虫体作阳性对照#也可采用等效4H,提取试剂盒提取虫体4H,#*%!%’!$%&扩增采用=’#@反应体系#引物#20;%#20终浓度为$%’#78?!@)$’D./0缓冲液=#@):H#.J终浓度为&’’#78?!@)氯化镁终浓度为$%=778?!@)热启动!*/聚合酶&N)模板’虫体4H,(=#@)无菌去离子水补足体积至=’#@#循环参数*(=A$’77+(A;’J)-BA;’J)B&A(’J)’个循环+然后B&A延伸$=759#*%!%$!结果观察用$%=M琼脂糖凝胶进行电泳检测扩增产物#在凝胶成像系统中观察有无;BEF大小的特异性条带#如有必要应进行测序#序列参见附录/##!$%&检测方法送达实验室的样品)不经虫体培养)直接用./0方法检测#操作程序同1%&#&%!结果判定&%%&!在连续B:培养观察中)任何一次镜检中发现病原)判定样品胎儿毛滴虫检测阳性#&%%!!用./0直接检测样品)若阳性对照成立)从样品检测结果为阳性)判定胎儿毛滴虫./0检测阳性)否则判定胎儿毛滴虫./0检测阴性#&%%’!如至第B天镜检仍未发现病原)./0检测为阴性)判定样品胎儿毛滴虫检测阴性#;!!#!#$!%&%附!录!(’规范性附录(培养基和试剂(%&!胎儿毛滴虫运输培养基’#)#*(硫乙醇酸盐培养基!!!!!!!!!!!!!!&(%1O蒸馏水$’’’7@$$=A高压后)冷却至=-A加入*灭能牛血清$’’7@青霉素$’’’’’N链霉素$O真菌抑制剂&7@将培养基混匀后分装到$’7@的灭菌试管中)每管=7@)置冰箱中冷藏)应&周内使用#(%!!改良’+,-./0培养基胰蛋白胨!!!!!!!!!!!!!!!!!!&O酵母提取物$O麦芽糖’%=O盐酸半胱氨酸’%$O抗坏血酸’%’&O磷酸氢二钾’%’1O磷酸二氢钾’%’1O蒸馏水(’7@调FP值为B%&B%)再加’%’=O琼脂糖)$&$A高压灭菌$’759)降至(A)然后加*灭活牛血清’=-A加热;’759($’7@#青霉素!粉!!!!!!!!!!!!!!!!!$’’’’’N硫酸链霉素’%$O每管$’7@分装#A保存备用#(%’!吉姆萨染液吉姆萨色素!!!!!!!!!!!!!!!!!!’%-O甘油=’7@甲醇=’7@将吉姆萨染料加入甘油中)于==A-’A下加热$%=L&L后)再加甲醇=’7@数天后过滤)即为原液#使用时)将其稀释&’倍作为工作液#(%$!细胞裂解液$’’778?!@#C5JIP/?!FP1%’!!#!#$!%&%&=778?!@+4#,FP1%’’%=MG4G’%$7O!7@!蛋白酶Q(%(!’-.1!2乙酸钠称量’%1OH6,R-;P&)置于$’’7@&’’7@烧杯中)加入’7@的去离子水搅拌溶解+加入冰乙酸调节FP值至=%&)加去离子水将溶液定容至$’’7@#高温高压灭菌后)室温保存#=!!#!#$!%&%附!录!3’资料性附录(牛胎儿毛滴虫模式图!!$波动膜+&动基体+;胞口+核+=轴柱#图3%&!牛胎儿毛滴虫模式图-!!#!#$!%&%附!录!%’资料性附录(胎儿毛滴虫扩增的序列!!RRSORROSSOO6SR6OSSSROSS66S66SS6R666R6S6SSSSSSS66SSSRS6S66RS6SSS6S6R6666SS666R6R6S66SRS666666SSS6O6RRSS6OOR66SOO6SOSRSSOORSSRSS6R6RO6SO66O66ROSSOR6S66SORO6S66OROORSOO6SS6ORSSSRSSSORO6R66OSSRO6SRSSSO66SOR6R6SSORORORROSSSS6ORSSORS6O66R6ROR6S6S6SOSS6R6OS66RRR6S6SS66SSS66S6RR666SSRSRSSSSS66OR6666O6ORO66666R666S6SOS6SS66R6666OOOSSRSOSRSR6S6S6OO66O6RRRO!!#!#$!%&%