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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２６６５—２０１０香蕉枯萎病菌检疫鉴定方法犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犉狌狊犪狉犻狌犿狅狓狔狊狆狅狉狌犿犳．狊狆．犮狌犫犲狀狊犲２０１０１１０１发布２０１１０５０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：陈定虎、杨雷亮、罗利娟、王章根、邱德义、王云华、管维。Ⅰ犛犖／犜２６６５—２０１０香蕉枯萎病菌检疫鉴定方法１ 范围本标准规定了对进出境香蕉种苗、组培苗及其他香蕉种质资源、商品用香蕉等中香蕉枯萎病菌（犉狌狊犪狉犻狌犿狅狓狔狊狆狅狉狌犿ｆ．ｓｐ．犮狌犫犲狀狊犲）的检疫和鉴定方法。本标准适用于所有进出境香蕉种苗、组培苗及其他香蕉种质资源、商品用香蕉等中的香蕉枯萎病菌的检疫。２ 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＳＮ／Ｔ１５３８．１ 培养基制备指南 第１部分：实验室培养基制备质量保证通则３ 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１犘犇犃培养基 犘犇犃犿犲犱犻狌犿马铃薯葡萄糖琼脂培养基，用于分离植物病原真菌。３．２犢犘犇培养液 犢犘犇犾犻狇狌犻犱犿犲犱犻狌犿酵母蛋白胨葡萄糖培养液，用于培养香蕉枯萎病菌产生分生孢子。３．３厚垣孢子 犮犺犾犪犿狔犱狅狊狆狅狉犲由菌丝个别细胞膨大形成，具有厚壁和浓缩的原生质，可抵抗高温、低温、干旱、营养短缺等不良环境条件的一种休眠孢子。４ 原理香蕉枯萎病又称香蕉巴拿马病、黄叶病，是破坏维管束导致植株死亡的毁灭性病害，其病原菌为尖孢镰刀菌古巴专化型，其英文名为ＢａｎａｎａＦｕｓａｒｉｕｍＷｉｌｔ，Ｂａｎａｎａｂａｎａｍａｄｉｓｅａｓｅ，学名为犉狌狊犪狉犻狌犿狅狓狔狊狆狅狉狌犿ｆ．ｓｐ．犆狌犫犲狀狊犲。属于半知菌亚门（Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ），丝孢纲（Ｈｙｐｈｏｍｙｃｅｔｅｓ），瘤座孢目（Ｔｕｂｅｒｃｕｌａｒｉａｌｅｓ）。该病原菌的危害症状、菌落的形态特征、致病性测定结果和寄主范围是鉴定该病菌的依据。５ 仪器设备和试剂５．１ 仪器设备电子天平（感量１／１００００ｇ）、超净工作台、高压灭菌锅、低温冰箱、纯水器、可调微量加样器（２μＬ～１犛犖／犜２６６５—２０１０２００μＬ）、培养箱、光学显微镜、照相机、铲、枝剪、砍刀、纸袋、油性笔、小刀片、培养皿、载玻片、盖玻片、镊子、挑针、酒精灯等。５．２ 试剂和材料无水乙醇、７０％乙醇、琼脂糖、琼脂、酵母浸出粉、蛋白胨、葡萄糖、０．１％升汞、灭菌水、４０％甘油、巴西蕉、广东香蕉２号等。培养基配制按ＳＮ／Ｔ１５３８．１规定。６ 现场检查取样时应进行针对性检查，注意检查有无可疑病株。若有可疑病株应将其挑出来，并送实验室作进一步检验鉴定。在以上针对性检查基础上，再按照相关标准规定进行取样。７ 实验室检验７．１ 症状检查受侵染的植株的症状参见附录Ａ。７．２ 保湿培养取待检样品的组织切成１ｃｍ长的小段，用自来水冲洗掉表面的泥土杂物后，在７５％的酒精溶液中浸泡１ｍｉｎ，经灭菌水洗涤后，用灭菌解剖刀横切成长度为１ｍｍ～４ｍｍ的小片，放置在垫有３层灭菌湿滤纸的培养皿中，每皿５片～１０片，转至２５℃培养箱或培养架上培养，黑暗和紫外光照各１２ｈ交替，观察植物残体表面是否出现白色菌丝或霉状物。７．３ 病菌的分离培养从病株病健交界处切取小块组织，采取常规组织分离法进行分离：将香蕉球茎组织切成１ｃｍ～１．５ｃｍ的方块，先放入７０％乙醇溶液中１０ｓ，再转入０．１％升汞溶液中浸泡１ｍｉｎ～２ｍｉｎ，进行表面消毒处理，然后用灭菌水漂洗３次，于无菌滤纸上晾干，用无菌刀片除去外皮后再细切成０．３ｃｍ～０．５ｃｍ的小方块，置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，２５℃下培养；小苗则是将球茎切成约０．３ｃｍ的小方块，先放于７０％乙醇溶液中浸５ｓ，再转入０．１％升汞溶液中浸泡１５ｓ～６０ｓ进行表面消毒处理，灭菌水漂洗３次后于无菌滤纸上晾干，置于ＰＤＡ平板上，２５℃下于ＰＤＡ培养基上培养，待长出菌落后再对其形态进行显微观察，挑取菌落边缘菌丝进行单孢分离。７．４ 病原菌致病性测定采用病原菌孢子悬浮液接种香蕉组培苗来确定病原菌致病性。将分离、纯化得到的病原菌菌株在２５℃酵母蛋白胨葡萄糖培养液（ＹＰＤ培养液参见附录Ｂ）中、黑暗条件下振荡培养２ｄ～３ｄ，即可产生大量的小型分生孢子。离心去除培养液并用无菌水冲洗，然后配制成浓度约为１×１０６个孢子／ｍＬ的孢子悬浮液。供试蕉苗的品种为巴西、广东香蕉２号，每个菌株接种香蕉苗不少于３０株。采用伤根浸菌接种法：将４叶期～５叶期健康组培香蕉苗自沙床中拔出，然后用缓慢流出的自来水冲洗根部以去除附在其根上的沙子（无需专门伤根，因自沙子中拔出和用自来水冲洗已造成对蕉苗根的２犛犖／犜２６６５—２０１０损伤），再分别浸在配制好的各分离菌株孢子悬浮液中，以清水做对照，３０ｍｉｎ后移栽到盛有灭菌细沙的营养杯，置于温室（２５℃～３２℃），正常淋水管理，但不喷任何农药，接种后１５ｄ～２０ｄ即可观察蕉苗的发病症状，然后再对发病植株进行病菌分离培养和鉴定。８ 鉴定标准８．１ 营养体及繁殖器官形态在ＰＤＡ培养基的菌落呈白色絮状，基质淡紫或淡紫红色；培养５ｄ～７ｄ可产生大量小型分生孢子，培养１０ｄ～１５ｄ产生少量大型分生孢子，培养３０ｄ后有厚垣孢子形成；香蕉枯萎病菌大型分生孢子（参见附录Ｃ）有３～５个分隔，镰刀形，薄壁，基部足细胞明显，顶部细胞渐细，大小为（２７μｍ～５５μｍ）×（３．３μｍ～５．５μｍ）；散生在菌丝上的小型分生孢子（参见附录Ｃ）常见，单胞或双胞，椭圆型至腊肠形，大小为（５μｍ～１６μｍ）×（２．４μｍ～３．５μｍ），着生于侧生分生孢子梗的瓶梗上，无色；菌核蓝黑色；厚垣孢子椭圆形至球形，顶生或间生，单生或２个联生；菌核蓝黑色；厚垣孢子（参见附录Ｃ）椭圆形至球形，顶生或间生，单生或２个联生。８．２ 致病性测定如果经致病性测定可以导致：巴西蕉和广东香蕉２号蕉苗叶片褪绿、无光泽，呈黄绿色或局部甚至整叶黄化；横剖假茎基部可见褐色至红褐色的坏死斑点，严重时整个假茎全部变为褐色；部分根变褐腐烂；并且从发病植株上进行病菌再分离培养，可以得到与原接种菌相同培养性状和形态特征的病原菌，即可判定该病菌为香蕉枯萎病原菌古巴专化型。９ 结果判定如果症状和分离物的各形态特征与描述的症状和病原菌形态相吻合，即可鉴定为犉狌狊犪狉犻狌犿狅狓狔狊狆狅狉狌犿ｆ．ｓｐ．犆狌犫犲狀狊犲。１０ 样品及菌株的保存保存样品应按品种分别存放，保存样品经登记和经手人签字后置低温干燥、防虫处保存２个月，如果鉴定为香蕉枯萎病原菌，该样品至少需保存６个月，同时保留电泳图片，以备复验、谈判和仲裁。保存期满后，需经灭菌处理。对判定为香蕉枯萎病菌的菌株的存放要进行标注，包括菌株来源、寄主的品系、分离时间、分离人和鉴定人；将菌株孢子移至４０％甘油管保存在－８０℃冰箱，或将菌株培养在试管斜面上，长满后存于４℃冰箱。３犛犖／犜２６６５—２０１０附 录 犃（资料性附录）香蕉枯萎病的症状特点犃．１ 总则香蕉的各个生长期，从幼小的吸芽至成株期都能发病。由于各个生长期土壤类型等情况的不同，外部症状也有些差异；病原菌的不同小种，也会导致不完全相同的症状。犃．２ 外部症状病株开始在下部的叶片及在外边的叶鞘先呈现特异的黄色，这种黄色病变初表现于叶片边缘，后逐渐向中肋扩展，发病后的叶子迅速萎蔫，叶柄在靠近叶鞘外折曲下来，在几天之内，其他叶子相继下垂，由黄色变呈褐色而干枯。也有一些叶子没有变黄便垂挂下来，倒挂于假茎的四周。一般假茎中心的最后一张顶叶，往往很迟伸出或不能抽出。经过一段时间后，整株枯死，形成一条枯杆，倒挂着干枯的叶子。有些病株假茎外面近地面处起，还常表现一条或长或短的纵裂缝。犃．３ 内部症状香蕉枯萎病菌是侵染维管束的病害，感病初期在病株下部根茎处横剖开观察，可见中柱髓部和皮层薄壁组织间，有黄色或红棕色的斑点，为被病原菌侵染后坏死的维管束。这种变色也有集中在髓部和外皮层之间的，内皮层内面维管束形成一圈坏死。若纵向剖开病株根茎，可看到初发病的组织有黄红色病变的维管束，近茎基部，病变颜色很深，越向上病变颜色渐渐变淡。在根部木质导管上，常产生红棕色病变，一直延伸至根茎部；至后期，大部分根变黑褐色而干枯。病茎旁所生吸芽的导管也会受侵染，纵剖球茎，可以看到红棕色的维管束从母株延伸侵染的迹象。病害严重的植株，整个球茎内部明显地变为深红色及棕褐色，中柱和内层的叶鞘变褐色；剖开病组织，有一种特异而不是臭的气味。只有在其他微生物再次侵染后，才腐烂发臭。４犛犖／犜２６６５—２０１０附 录 犅（资料性附录）培养基的配制 酵母蛋白胨葡萄糖（ＹＰＤ）培养液配制：酵母浸出粉１０ｇ，蛋白胨２０ｇ，葡萄糖２０ｇ，加热溶解在１０００ｍＬ水中，分装三角瓶并高压灭菌。５犛犖／犜２６６５—２０１０附 录 犆（资料性附录）香蕉枯萎病菌的形态特征图 Ａ、Ｂ———香蕉枯萎病菌在ＰＤＡ培养基上的菌落特征；Ｃ———小型分生孢子；Ｄ———大型分生孢子；Ｅ———厚垣孢子；Ｆ———小型分生孢子着生在产孢细胞上。图犆．１ 香蕉枯萎病菌的形态特征图（引自王文华）６犛犖／犜２６６５—２０１０