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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２５２８—２０１０饮用水中军团菌检测犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犔犲犵犻狅狀犲犾犾犪犻狀犱狉犻狀犽犻狀犵狑犪狋犲狉２０１００３０２发布２０１００９１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布食品伙伴网书书书中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准饮用水中军团菌检测ＳＮ／Ｔ２５２８—２０１０中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６ ６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６ 印张０．７５ 字数１６千字２０１０年５月第一版 ２０１０年５月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２０８６０ 定价１６．００元食品伙伴网书书书前 言 本标准的附录Ａ为规范性的附录，附录Ｂ为资料性的附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国山西出入境检验检疫局。本标准主要起草人：李晓虹、李卫华、韩伟。本标准是首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２５２８—２０１０食品伙伴网饮用水中军团菌检测１ 范围本标准规定了饮用水中军团菌的检测方法。本标准适用于饮用水中军团菌的检测。工业用水和天然水及其沉淀物、沉积物和粘土／软泥等相关样本进行军团菌检测可参考此法。２ 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＧＢ／Ｔ２７４０３ 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测ＧＢ／Ｔ２７４０５ 实验室质量控制规范 食品微生物检测ＳＮ／Ｔ１５３８．１ 培养基制备指南 第１部分：实验室培养基制备质量保证通则ＳＮ／Ｔ１５３８．２ 培养基制备指南 第２部分：培养基性能测试实用指南３ 定义和术语下列术语和定义适用于本标准。３．１ 军团菌 犔犲犵犻狅狀犲犾犾犪本细菌为两端钝圆，具有端鞭毛，有动力，无芽孢和荚膜，需氧和兼性厌氧的大小为（０．３μｍ～０．４μｍ）×（２．０μｍ～３．０μｍ）或（０．５μｍ～０．７μｍ）×（２．０μｍ～２０μｍ）的革兰氏阴性杆菌。４ 设备和材料４．１ 培养箱：３６℃±１℃。４．２ 吸管：１ｍＬ、５ｍＬ和１０ｍＬ，分刻度０．１ｍＬ。４．３ 接种环：直径３ｍｍ。４．４ 天平：感量０．１ｇ。４．５ 真空过滤系统。４．６ 灭菌平皿：皿底直径９ｃｍ。４．７ 浊度仪。４．８ ＰＣＲ扩增仪。４．９ 台式离心机：最高离心力１３０００ｒ／ｍｉｎ。４．１０ 低倍双目显微镜。４．１１ 恒温水浴锅：３６℃±１℃。４．１２ 黑色硝化纤维素过滤膜：直径４７ｍｍ～５０ｍｍ，孔径０．４５μｍ。Ｍｉｌｉｐｏｒｅ或同类产品。４．１３ 微量可调移液器。１μＬ～１０μＬ，１００μＬ，２００μＬ，１０００μＬ。４．１４ 旋涡振荡器。４．１５ 电泳仪。４．１６ 凝胶成像分析系统。１犛犖／犜２５２８—２０１０食品伙伴网４．１７ 微波炉。４．１８ 玻璃仪器。５ 培养基和试剂除另有规定外，所用试剂均为分析纯，试验用水和培养基配制应符合ＧＢ／Ｔ２７４０５和ＧＢ／Ｔ２７４０３的规定。５．１ 缓冲酵母浸膏琼脂培养基（ＢＣＹＥ）：见附录第Ａ．１章。５．２ 缓冲酵母浸膏琼脂培养基（ＢＣＹＥＣｙｓ）：见附录第Ａ．２章。５．３ 选择性培养基（ＧＶＰＣ培养基）：见附录第Ａ．３章。５．４ 血平板：见附录第Ａ．４章。５．５ 酸缓冲液：见附录第Ａ．５章。５．６ Ｐａｇｅ’盐：见附录第Ａ．６章。５．７ ２×犜犪狇ＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ［０．１Ｕ犜犪狇Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ／μＬ、５００μｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｅａｃｈ、２０ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１００ｍｏｌ／ＬＫＣｌ、３ｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２］。５．８ ＰＣＲ引物：见表１。表１ 军团菌引物序列及扩增片段长度基因引物名称引物序列（５’３’）扩增片段大小／ｂｐ５ＳｒＲＮＡＳ１ＡＣＴＡＴＡＧＣＧＡＴＴＴＧＧＡＡＣＣＡＳ２ＧＣＧＡＴＧＡＣＣＴＡＣＴＴＴＣＧＣＡＴ１０４ＭｉｐＳ３ＡＴＧＡＴＡＧＣＴＴＡＴＧＡＣＴＧＧＴＡＳ４ＴＴＣＣＴＴＴＧＴＴＣＡＣＴＣＡＧＴＡＴ９９６５．９ 琼脂糖（电泳级）。５．１０ 溴化乙锭。５．１１ ＤＮＡｍａｒｋｅｒ。５．１２ ＴＡＥ电泳储备液（５０×）：见附录第Ａ．７章。５．１３ 军团菌分型诊断试剂盒。６ 检验程序军团菌检验程序见图１。图１ 军团菌的检测程序２犛犖／犜２５２８—２０１０食品伙伴网７ 检验步骤７．１ 取样７．１．１ 总则根据给水系统和检验目的确定收集样品的体积。要详细记录样品的来源、体积、取样时的温度和是否含有灭菌剂及其性质，以助于实验室检测。基于安全和分析原因，不要检测未知来源的样品或是冷却水、过程水，除非这些样品有关于化学添加物的信息，或是在过程中可能存在的污染物的信息。７．１．２ 取样容器用无菌玻璃、聚乙烯或类似容器收集水样品１０ｍＬ～１０００ｍＬ。样品容器的材料也应适用于饮用水。若离试样点较远，使用易碎的玻璃容器不安全的，可使用塑料制品。７．１．３ 含生物防腐剂的样品如果水样含有或是认为含有氧化型灭菌剂时，在取样时或取样前应先使其钝化。注：对于氯和其他氧化型灭菌剂，可通过加硫代硫酸钾或硫代硫酸钠到容器中钝化。７．１．４ 样品运输和储存实验室接到水样后应尽快进行微生物学分析，最好是取样当天，最多不超过２ｄ。如果是在取样的当天分析，样品运输时在室温状态下，避免光照就可以了。否则，需在冷藏条件５℃±３℃下运输样品。热水样应在取样后直接冷却。７．２ 膜过滤过滤１０ｍＬ～１０００ｍＬ水样。按照以下步骤通过酸缓冲液处理样品，以抑制非军团菌的生长。样品过滤后，加入３０ｍＬ酸缓冲液，静置５ｍｉｎ。膜过滤去酸缓冲液，用２０ｍＬＰａｇｅ’盐或其他洗液洗涤膜。小心地用无菌镊子转移膜，正面向上放置在ＢＣＹＥ或ＧＶＰＣ琼脂平板上，确保没有气泡。７．３ 培养倒置平板在３６℃±１℃培养２ｄ～１０ｄ。培养期间保持湿润的培养环境。７．４ 检查平板在１０ｄ的培养期间，经常观察。用显微镜在３ｄ～４ｄ内至少观察两次。记录可疑军团菌菌落的数量。军团菌的生长很可能被其他菌掩盖或抑制。如果怀疑被抑制，或是有强的生长背景，需重新稀释样品或减少过滤的样品体积。在黑色滤膜或黑色背景下，典型的军团菌菌落通常是白灰蓝紫，但也可能出现棕色、粉色、灰绿色或深红色。军团菌表面光滑，边缘整齐，出现典型的毛玻璃现象。注：通过膜过滤的军团菌在培养基的生长更加缓慢，且通常菌落比直接在培养基上生长的要小。７．５ 可疑军团菌的确证７．５．１ 犅犆犢犈犆狔狊的二次培养在ＢＣＹＥ或ＧＶＰＣ平板上次日生长的菌落均不是军团菌。从ＢＣＹＥ或ＧＶＰＣ平板上选择２ｄ后生长的至少５个可疑军团菌菌落接种到ＢＣＹＥ和ＢＣＹＥＣｙｓ两块平板上进行二次培养，如果可疑菌落的形状不同，确保每一形状至少挑取两个菌落，３６℃±１℃培养至少２ｄ。在ＢＣＹＥ平板上生长而在ＢＣＹＥＣｙｓ平板或血平板上不生长的被认为是军团菌。记录每个平板的结果。７．５．２ 血清学鉴定从ＢＣＹＥ或ＧＶＰＣ平板上挑取可疑菌落纯化后，用多价诊断血清作玻片凝集实验。有条件的可作分型实验。７．５．３ 犘犆犚检测７．５．３．１ 犘犆犚模板的制备挑取从ＢＣＹＥ或ＧＶＰＣ平板上可疑纯菌落混于１００μＬ蒸馏水中，振荡混匀，１００℃煮沸５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ，１００００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取上清液作为模板。７．５．３．２ 多重犘犆犚反应体系和条件———反应体系体积为５０μＬ：１０μｍｏｌ／Ｌ引物Ｓ１、Ｓ２各１μＬ，２０μｍｏｌ／Ｌ引物Ｓ３、Ｓ４各５μＬ；２×３犛犖／犜２５２８—２０１０食品伙伴网犜犪狇ＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ２５μＬ；模板ＤＮＡ３μＬ；ｄｄＨ２Ｏ补足５０μＬ；———反应条件：９５℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性１ｍｉｎ，６０℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸１ｍｉｎ，３０个循环，７２℃延伸５ｍｉｎ，４℃保存反应产物。７．５．３．３ 犘犆犚质控对照每次进行ＰＣＲ检测时均需要设置阳性对照、阴性对照和空白对照。其中，用军团菌标准阳性菌株提取的ＤＮＡ作阳性对照。用非军团菌的标准菌株提取的ＤＮＡ作阴性对照。用灭菌双蒸水替代模板作空白对照。７．５．３．４ 犘犆犚扩增产物电泳检测取１．５ｇ琼脂糖于１００ｍＬ电泳缓冲液中加热，充分融化，加入溴化乙锭，使其最终浓度达到１．０μｇ／ｍＬ，制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过胶面１ｍｍ。取１０．０μＬＰＣＲ扩增产物点样。９Ｖ／ｃｍ恒压，电泳２０ｍｉｎ～３０ｍｉｎ。紫外凝胶成像仪下观察电泳结果，做好记录。ＰＣＲ扩增产物为１０４ｂｐ、９９６ｂｐ（见表１）。８ 结果及报告８．１ 当在ＢＣＹＥ或ＧＶＰＣ平板上次日生长者，报告未检出军团菌／过滤水的体积。８．２ 当在ＢＣＹＥ或ＧＶＰＣ平板上不生长，或在ＢＣＹＥ／ＧＶＰＣ平板上生长而在ＢＣＹＥＣｙｓ／血平板上也生长时，报告未检出军团菌／过滤水的体积。８．３ 当在ＢＣＹＥ或ＧＶＰＣ平板上生长而在ＢＣＹＥＣｙｓ或血平板上不生长的，同时血清凝集实验阳性者，报告检出军团菌／过滤水的体积。８．４ 当在ＢＣＹＥ或ＧＶＰＣ平板上生长，同时ＰＣＲ产物扩增出片段长度为１０４ｂｐ者，报告检出军团菌（非嗜肺军团菌）／过滤水的体积。８．５ 当在ＢＣＹＥ或ＧＶＰＣ平板上生长，同时ＰＣＲ产物扩增出片段长度为１０４ｂｐ、９９６ｂｐ两条片断者，报告检出军团菌（嗜肺军团菌）／过滤水的体积。８．６ 定量计算。挑取的可疑菌落经鉴定后，计数方法如下：从ＢＣＹＥ或ＧＶＰＣ平板上计算出在３０个～３００个之间的可疑菌落数（若超出３００个要稀释），从可疑菌落中挑取５个进行确证，若有３个证实是军团菌，则３／５乘以ＢＣＹＥ或ＧＶＰＣ平板上在３０个～３００个之间的可疑菌落数，即为单位体积的可能军团菌数（ＣＦＵ／过滤水的体积）。９ 废弃物处理和防止污染的措施检测过程中防止交叉污染的措施参见附录Ｂ。４犛犖／犜２５２８—２０１０食品伙伴网附 录 犃（规范性附录）培养基和试剂犃．１ 一般要求为保证培养基的质量，宜按照ＳＮ／Ｔ１５３８．１和ＳＮ／Ｔ１５３８．２对培养基进行质量控制。犃．２ 缓冲酵母浸膏琼脂培养基（犅犆犢犈）犃．２．１ 成分酵母粉１０．０ｇ琼脂１２．０ｇ活性炭２．０ｇα酮戊二酸钾１．０ｇＡＣＥＳ缓冲液（犖２乙酰氨基２氨基乙磺酸）１０．０ｇ氢氧化钾２．８ｇＬ盐酸半胱氨酸０．４ｇ焦磷酸铁０．２５ｇ蒸馏水１０００ｍＬ犃．２．２ 制备犃．２．２．１ 半胱氨酸和铁盐溶液制备新鲜的Ｌ盐酸半胱氨酸和焦磷酸铁溶液：称取半胱氨酸和铁盐０．４ｇ和０．２５ｇ分别加到１０ｍＬ蒸馏水中。溶液通过孔径为０．２２μｍ的纤维素酯滤膜过滤灭菌。－２０℃存贮于灭菌容器中，时间不超过３个月。犃．２．２．２ 犃犆犈犛缓冲液犖２乙酰氨基２氨基乙磺酸加到５００ｍＬ蒸馏水中，４５℃～５０℃水浴溶解。称取氢氧化钾于４８０ｍＬ蒸馏水中，混匀至溶解。混合以上两种溶液即为ＡＣＥＳ缓冲液。犃．２．２．３ 培养基活性酵母浸膏和α酮戊二酸连续地加入到９８０ｍＬ的ＡＣＥＳ缓冲液中。０．１ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钾（５．６ｇ＋１Ｌ蒸馏水），０．１ｍｏｌ／ＬＨ２ＳＯ４（５．３ｍＬ＋１Ｌ蒸馏水）。用以上两种溶液调整培养基的ｐＨ至６．８±０．２。加入琼脂，１２１℃，１５ｍｉｎ高压灭菌。５℃避光保存于密闭容器内，不超过４个星期。犃．３ 缓冲酵母浸膏琼脂培