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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２５２５—２０１０食品中肉毒梭菌的犘犆犚检测方法犇犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犆犾狅狊狋狉犻犱犻狌犿犫狅狋狌犾犻狀狌犿犻狀犳狅狅犱狊犫狔犘犆犚２０１００３０２发布２０１００９１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布食品伙伴网书书书前 言 本标准参照美国ＦＤＡＢＡＭ第１７章第５部分：Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ型肉毒梭菌ＰＣＲ检测方法［Ｕ．Ｓ．ＦＤＡ，ＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌＡｎａｌｙｔｉｃａｌＭａｎｕａｌＯｎｌｉｎｅ，Ｃｈａｐｔｅｒ１７（Ｖ），２００１：ＳｐｅｃｉｆｉｃＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｏｔｕｌｉｎｕｍＴｙｐｅｓＡ，Ｂ，ＥａｎｄＦＵｓｉｎｇｔｈｅＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）．］经研究和验证后制定。本标准的附录Ａ、附录Ｂ均为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局。本标准主要起草人：陈双雅、谢明星、张永祥、陈伟玲、王群力、刘棠、彭小莉、周赞虎、张孟璋。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２５２５—２０１０食品伙伴网食品中肉毒梭菌的犘犆犚检测方法１ 范围本标准规定了食品中肉毒梭菌的ＰＣＲ检测方法。本标准适用于食品中Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ型肉毒梭菌的检测。２ 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＧＢ／Ｔ４７８９．１２ 食品卫生微生物学检验 肉毒梭菌及肉毒毒素检验ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析试验室用水规格和实验方法ＧＢ１９４８９ 实验室 生物安全通用要求ＧＢ／Ｔ２７４０３ 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测ＳＮ／Ｔ１１９３ 基因检验实验室技术要求３ 术语、定义和缩略语下列术语、定义和缩略语适用于本标准。３．１ 术语和定义３．１．１ 肉毒梭菌 犆犾狅狊狋狉犻犱犻狌犿犫狅狋狌犾犻狀狌犿肉毒梭菌为梭菌科梭菌属革兰氏阳性芽孢杆菌，厌氧，在适宜的培养基及特定的环境条件下产生一类具有很强毒性的神经麻痹毒素，即肉毒毒素。３．１．２ 聚合酶链式反应 狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲犮犺犪犻狀狉犲犪犮狋犻狅狀，犘犆犚模板ＤＮＡ先经高温变性成为单链，在ＤＮＡ聚合酶作用和适宜的反应条件下，根据模板序列设计的两条引物分别与模板ＤＮＡ两条链上相应的一段互补序列发生退火而相互结合，接着在ＤＮＡ聚合酶的作用下以四种脱氧核糖核酸（ｄＮＴＰ）为底物，使退火引物得以延伸，然后不断重复变性、退火和延伸这一循环，使位于两段已知序列之间的ＤＮＡ片段呈几何倍数扩增。３．２ 缩略语３．２．１ 犫狆 犫犪狊犲狆犪犻狉碱基对。３．２．２ 犇犖犃 犱犲狅狓狔狉犻犫狅狀狌犮犾犲犻犮犪犮犻犱脱氧核糖核酸。３．２．３ 犱犖犜犘 犱犲狅狓狔狉犻犫狅狀狌犮犾犲狅狊犻犱犲狋狉犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲脱氧核苷三磷酸。１犛犖／犜２５２５—２０１０食品伙伴网３．２．４ 犱犃犜犘 犱犲狅狓狔犪犱犲狀狅狊犻狀犲狋狉犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲脱氧腺苷三磷酸。３．２．５ 犱犆犜犘 犱犲狅狓狔犮狔狋犻犱犻狀犲狋狉犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲脱氧胞苷三磷酸。３．２．６ 犱犌犜犘 犱犲狅狓狔犵狌犪狀狅狊犻狀犲狋狉犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲脱氧鸟苷三磷酸。３．２．７ 犱犜犜犘 犱犲狅狓狔狋犺狔犿犻犱犻狀犲狋狉犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲脱氧胸苷三磷酸。３．２．８ 犜犪狇 犜犺犲狉犿狌狊犪狇狌犪狋犻犮狌水生栖热菌。３．２．９ 犜狉犻狊 狋狉犻狊（犺狔犱狉狅狓狔犿犲狋犺狔犾）犪犿犻狀狅犿犲狋犺犪狀犲三（羟甲基）氨基甲烷。３．２．１０ 犈犇犜犃 犲狋犺狔犾犲狀犲犱犻犪犿犻狀犲狋犲狋狉犪犪犮犲狋犻犮犪犮犻犱乙二胺四乙酸。４ 生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测肉毒梭菌，所有培养物和废弃物应小心处置，并按照ＧＢ１９４８９和ＧＢ／Ｔ２７４０３中的有关规定执行。５ 防污染措施检测过程中防止交叉污染的措施按照ＳＮ／Ｔ１１９３中的规定执行。６ 方法提要样品经增菌后划平板分离单菌落，挑取可疑菌落到ＴＰＧＹ培养，对培养物采用热裂解抽提ＤＮＡ法，或商品化细菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒抽提ＤＮＡ法制备ＰＣＲ模板，进行ＰＣＲ扩增，琼脂糖凝胶电泳检验ＰＣＲ产物是否有特征条带，从而对食品中是否污染肉毒梭菌进行快速检验。７ 设备和材料７．１ 天平：感量０．００１ｇ。７．２ 生物安全柜。７．３ 厌氧培养装置。７．４ 恒温培养箱：３５℃±１℃和２８℃±１℃。７．５ 高压灭菌锅。７．６ 恒温水浴：３７℃±１℃和６０℃±１℃。２犛犖／犜２５２５—２０１０食品伙伴网７．７ 高速台式冷冻离心机：１４０００犵。７．８ 冰箱：－２０℃和－７０℃。７．９ ＰＣＲ仪。７．１０ 电泳仪。７．１１ 凝胶成像分析系统。７．１２ 紫外分光光度计。７．１３ 微量可调移液器：０．２μＬ～２μＬ、２μＬ～２０μＬ、２０μＬ～２００μＬ、１００μＬ～１０００μＬ。７．１４ 离心管：１．５ｍＬ。７．１５ ＰＣＲ反应管：２００μＬ～５００μＬ。８ 培养基和试剂除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，水应符合ＧＢ／Ｔ６６８２中一级水的规格。８．１ 庖肉培养基：见附录第Ａ．１章。８．２ 胰蛋白胨葡萄糖酵母浸膏肉汤（ＴＰＧＹ）：见附录第Ａ．２章。８．３ 厌氧卵黄琼脂：见附录第Ａ．３章。８．４ 无水乙醇和９５％乙醇。８．５ ＰＢＳ缓冲液：氯化钠７．６５０ｇ／Ｌ、磷酸氢二钠０．７２４ｇ／Ｌ、磷酸二氢钾０．２１０ｇ／Ｌ（ｐＨ７．４）。８．６ ＴＥ缓冲液：１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）。８．７ 蛋白酶Ｋ溶液：用ＴＥ配制，使用浓度为１０ｍｇ／ｍＬ。８．８ 溶菌酶溶液：用ＴＥ配制，使用浓度为１０ｍｇ／ｍＬ。８．９ ３ｍｏｌ／Ｌ乙酸钠溶液（ｐＨ５．２）。８．１０ ２０％ＳＤＳ溶液。８．１１ 引物：根据附录Ｂ中表Ｂ．１的序列合成引物，加超纯水配制成１００μｍｏｌ／Ｌ储液，用于ＰＣＲ测试的引物浓度为１０μｍｏｌ／Ｌ。８．１２ 犜犪狇ＤＮＡ聚合酶。８．１３ ｄＮＴＰ：ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ。８．１４ 琼脂糖：电泳级。８．１５ 溴化乙锭。８．１６ ＤＮＡ分子量标准。８．１７ 阳性对照：含有扩增片段的质粒或Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ型肉毒梭菌的基因组ＤＮＡ。８．１８ 商品化细菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒。８．１９ １０×ＰＣＲ缓冲液：２００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．４）、２００ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钾、１５ｍｍｏｌ／Ｌ氯化镁。８．２０ ５×ＴＢＥ电泳缓冲液：Ｔｒｉｓ５４ｇ、硼酸２７．５ｇ、０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）２０ｍＬ，加蒸馏水至１０００ｍＬ，使用时稀释为０．５×ＴＢＥ电泳缓冲液。８．２１ ６×加样缓冲液：３０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，３６％（体积分数）甘油，０．０５％（质量浓度）二甲苯腈蓝ＦＦ，０．０５％（质量浓度）溴酚蓝。９ 检验程序检验程序见图１。３犛犖／犜２５２５—２０１０食品伙伴网图１ 肉毒梭菌犘犆犚检测程序１０ 检验步骤１０．１ 样品制备和增菌培养接种前，先将增菌培养基煮沸１０ｍｉｎ～１５ｍｉｎ，以排除溶解于培养基中的氧，并迅速冷却，切勿摇动。每１５ｍＬ增菌肉汤中接种１ｇ～２ｇ固体食品或１ｍＬ～２ｍＬ液体食品，接种时将接种物慢慢接入肉汤液面以下。每份样品接种两管庖肉培养基，置３５℃±１℃，同时接种两管ＴＰＧＹ培养基，置２８℃±１℃，厌氧培养５ｄ。检查培养物的浊度、产气、肉粒的消化和产生的气味。若有生长，按１０．２分离纯培养物。若未见生长，则继续培养１０ｄ。１０．２ 分离纯培养物取１ｍＬ～２ｍＬ培养液置于螺旋帽试管中，加入等量过滤除菌的无水乙醇。混匀，在室温下放置１ｈ。或８０℃加热１０ｍｉｎ～１５ｍｉｎ以破坏其繁殖体。用接种环取１环～２环经乙醇或加热处理的培养物在厌氧卵黄琼脂上划线接种，置厌氧条件下３５℃±１℃培养４８ｈ。挑取约１０个单个的典型菌落。肉毒梭菌的菌落为隆起或扁平，光滑或粗糙，容易蔓延生长并有不规则边缘。在卵黄培养基上用斜射光检查时，菌落表面通常呈虹彩样，亦称为珠色层。彩带通常向外延伸，继而菌落产生不规则外形。接种可疑菌落到ＴＰＧＹ培养基中，置３５℃±１℃厌氧培养２４ｈ。１０．３ 模板犇犖犃的制备以下两种方法任选一种进行。剩余培养液置４℃保存，以备确证试验使用。１０．３．１ 热裂解抽提犇犖犃法取１．４ｍＬＴＰＧＹ培养物转移至１．５ｍＬ离心管中，１４０００犵离心２ｍｉｎ，弃去上清液。加入１．０ｍＬＰＢＳ悬浮菌体沉淀，１４０００犵离心２ｍｉｎ，去上清。用４００μＬＰＢＳ重悬沉淀，加入１０ｍｇ／ｍＬ溶菌酶溶液１００μＬ，３７℃±１℃水浴１５ｍｉｎ，期间每５ｍｉｎ～７ｍｉｎ颠倒混匀离心管。加入１０ｍｇ／ｍＬ蛋白酶Ｋ溶液１０μＬ，６０℃±１℃水浴１ｈ，期间每１０ｍｉｎ～１５ｍｉｎ颠倒混匀离心管。沸水浴１０ｍｉｎ，１４０００犵离心２ｍｉｎ，上清液转移至新的灭菌小离心管中。加入３ｍｏｌ／ＬＮａＡｃ溶液５０μＬ和９５％乙醇１．０ｍＬ，颠４犛犖／犜２５２５—２０１０食品伙伴网倒混匀，－７０℃或－２０℃放置３０ｍｉｎ，１４０００犵离心１０ｍｉｎ，弃去上清，沉淀干燥后溶于２００μＬＴＥ溶液。按１０．４进行纯度和浓度测定后置于－２０℃保存。１０．３．２ 试剂盒抽提犇犖犃法取１．４ｍＬＴＰＧＹ培养物转移至１．５ｍＬ离心管中，１４０００犵离心２ｍｉｎ，弃去上清液。菌体沉淀用１．０ｍＬＴＥ缓冲液洗两次后重悬于１２０μＬ的２５％蔗糖溶液中。加入１０ｍｇ／ｍＬ溶菌酶溶液１２０μＬ，混匀，３７℃±１℃水浴３０ｍｉｎ；然后加入２０％ＳＤＳ溶液３０μＬ，轻轻混匀，室温放置５ｍｉｎ；再加入１０ｍｇ／ｍＬ蛋白酶Ｋ溶液９．０μＬ，混匀后３７℃±１℃水浴３０ｍｉｎ。悬浮液采用商品化细菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒提取ＤＮＡ，使用时按照试剂盒说明书进行操作。提取的ＤＮＡ按１０．４进行纯度和浓度测定后置于－２０℃保存。１０．４ 核酸纯度和浓度的测定取适量ＤＮＡ溶液原液加双蒸水稀释一定倍数后，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测２６０ｎｍ和２８０ｎｍ处的吸收值。ＤＮＡ的浓度按照式（１）计算。犮＝犃２６０×犖×５０…………………………（１） 式中：犮———ＤＮＡ浓度，单位为微克每毫升（μｇ／ｍＬ）；犃２６０———２６０ｎｍ处的吸光值；犖———核酸稀释倍数。当浓度为０．３４μｇ／ｍＬ～３４０μｇ／ｍＬ，犃２６０／犃２８０比值在１．７～１．９之间时，适宜于ＰＣＲ扩增。１０．５ 犘犆犚扩增１０．５．１ 采用分别针对Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ型肉毒梭菌肉毒毒素基因设计的型特异性引物（附录Ｂ中表Ｂ．１），进行多个ＰＣＲ扩增，每个ＰＣＲ反应管检测一种类型的肉毒梭菌。１０．５．２ ＰＣＲ反应体系和参数见附录Ｂ中表Ｂ．２和表Ｂ．３。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当的调整。１０．５．３ ＰＣＲ检测时反应体系应设置阳性对照、阴性对照和空白对照。用含有扩增片段的质粒或Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ型肉毒梭菌的基因组ＤＮＡ作阳性对照，用非肉毒梭菌基因组ＤＮＡ作阴性对照，用无菌水作空白对照。１０．６ 凝胶电泳检测犘犆犚产物用０．５×ＴＢＥ缓冲液制备１．２％～１．５％（质量浓度）的琼脂糖凝胶（凝胶加热融化后冷却至６０℃左右加入溴化乙锭至０．５μｇ／ｍＬ，或者在电泳后用０．５μｇ／ｍＬ溴化乙锭溶液进行染色），将１０μＬ的ＰＣＲ产物与２．０μＬ６×加样缓冲液混合，点样，其中一孔加入ＤＮＡ分子量