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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２５２４．２—２０１０进出口食品中变形杆菌检测方法第２部分：犕犘犖法犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犘狉狅狋犲犲犪犲狊狆犲犮犻犲狊犻狀犳狅狅犱狊犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋—犘犪狉狋２：犕犘犖犕犲狋犺狅犱２０１００３０２发布２０１００９１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布食品伙伴网书书书中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准进出口食品中变形杆菌检测方法第２部分：犕犘犖法ＳＮ／Ｔ２５２４．２—２０１０中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６ ６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６ 印张０．７５ 字数１５千字２０１０年５月第一版 ２０１０年５月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２０８５１ 定价１６．００元食品伙伴网书书书前 言 ＳＮ／Ｔ２５２４《进出口食品中变形杆菌检测方法》分为两个部分：———第１部分：定性检测方法；———第２部分：ＭＰＮ法。本部分为ＳＮ／Ｔ２５２４的第２部分。本部分的附录Ａ和附录Ｂ均为规范性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。本部分主要起草人：陈双雅、张永祥、蒋鲁岩、陈伟玲、王群力、祝长青、谢明星、刘棠、彭小莉、郭桂萍。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２５２４．２—２０１０食品伙伴网进出口食品中变形杆菌检测方法第２部分：犕犘犖法１ 范围ＳＮ／Ｔ２５２４的本部分规定了食品中变形杆菌的ＭＰＮ检测方法。本部分适用于食品中普通变形杆菌、奇异变形杆菌、摩根摩根氏菌、产碱普罗威登斯菌的ＭＰＮ检测。２ 规范性引用文件下列文件中的条款通过ＳＮ／Ｔ２５２４的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。ＳＮ／Ｔ１５３８．１ 培养基制备指南 第１部分：实验室培养基制备质量保证通则ＳＮ／Ｔ１５３８．２ 培养基制备指南 第２部分：培养基性能测试实用指南３ 术语和定义下列术语和定义适用于ＳＮ／Ｔ２５２４的本部分。３．１变形杆菌 犘狉狅狋犲犲犪犲通常将变形杆菌簇的细菌通称为变形杆菌。变形杆菌为肠杆菌科有动力的革兰氏阴性杆菌，无芽孢、无荚膜。分为三个独立的菌属，即变形杆菌属（犘狉狅狋犲狌狊）、摩根氏菌属（犕狅狉犵犪狀犲犾犾犪）和普罗菲登斯菌属（犘狉狅狏犻犱犲狀犮犻犪）。引起食物中毒的变形杆菌主要是普通变形杆菌（犘狉狅狋犲狌狊狏狌犾犵犪狉犻狊）、奇异变形杆菌（犘狉狅狋犲狌狊犿犻狉犪犫犻犾犻狊）、摩根摩根氏菌（犕狅狉犵犪狀犲犾犾犪犿狅狉犵犪狀犻犻）和产碱普罗菲登斯菌（犘狉狅狏犻犱犲狀犮犻犪犪犾犮犪犾犻犳犪犮犻犲狀狊）。４ 设备与材料４．１ 天平：最大称量２０００ｇ，感量０．１ｇ。４．２ 均质器。４．３ 培养箱：３６℃±１℃。４．４ 冰箱：４℃～－２０℃。４．５ 吸管：１ｍＬ（具０．０１ｍＬ刻度）、１０ｍＬ（具０．１ｍＬ刻度）或微量移液器及吸头。４．６ 试管：１５ｍｍ×１００ｍｍ。４．７ 培养皿：直径９０ｍｍ。４．８ 锥形瓶：２５０ｍＬ和５００ｍＬ。４．９ 显微镜。４．１０ 质控菌株：普通变形杆菌ＡＴＣＣ１３３１５Ｔ、奇异变形杆菌ＡＴＣＣ２９９０６Ｔ、摩根摩根氏菌ＡＴＣＣ２５８３０Ｔ、产碱普罗威登斯菌ＡＴＣＣ９８８６Ｔ或类似菌株。４．１１ ＡＰＩ２０Ｅ肠杆菌和其他革兰氏阴性杆菌鉴定试剂盒或类似产品。１犛犖／犜２５２４．２—２０１０食品伙伴网４．１２ ＶＩＴＥＫ全自动微生物分析系统或类似设备。注：ＡＰＩ２０Ｅ和ＶＩＴＥＫ是法国生物梅里埃公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。５ 培养基及试剂５．１ 缓冲蛋白胨水（ＢＰＷ）：见附录Ａ中第Ａ．１章。５．２ 肠杆菌增菌肉汤（ＥＥ肉汤）：见附录Ａ中第Ａ．２章。５．３ ＳＳ琼脂：见附录Ａ中第Ａ．３章。５．４ 伊红美兰琼脂（ＥＭＢ）：见附录Ａ中第Ａ．４章。５．５ 麦康凯琼脂（ＭＡＣ）：见附录Ａ中第Ａ．５章。５．６ 苯丙氨酸琼脂斜面：见附录Ａ中第Ａ．６章。５．７ 培养基和试剂的配制遵循ＳＮ／Ｔ１５３８．１和ＳＮ／Ｔ１５３８．２的要求。６ 方法提要与流程６．１ 方法提要应用“三管”增菌法，结合分离、生化鉴定等方法对食品中可能存在的致病性变形杆菌进行定量检测。６．２ 检测流程检测流程图见图１。图１ 变形杆菌犕犘犖检测流程图２犛犖／犜２５２４．２—２０１０食品伙伴网７ 检测步骤７．１ 样品制备称取２５ｇ（ｍＬ）样品，放入无菌均质杯中，加入２２５ｍＬＢＰＷ，以８０００ｒ／ｍｉｎ均质１ｍｉｎ～２ｍｉｎ；或放入无菌均质袋中，加入２２５ｍＬＢＰＷ，用拍击式均质器拍打１ｍｉｎ～２ｍｉｎ，制成１∶１０样品稀释液。冷冻样品应在４５℃以下不超过１５ｍｉｎ或在２℃～５℃不超过１８ｈ解冻。若不能及时检验，应放于－１５℃左右保存；非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置于６℃～１０℃冰箱保存，在２４ｈ内检验。７．２ 前增菌７．２．１ 用灭菌吸管吸取增菌液１ｍＬ，注入含有９ｍＬＢＰＷ的试管内，振荡试管混匀，并依次制备１０倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用一支１ｍＬ灭菌吸管。７．２．２ 根据对检样污染情况的估计，选择三个连续的适宜稀释度，最高稀释度应能达到获得阴性菌株。每个稀释度接种三支含有９ｍＬＢＰＷ的试管，每管接种１ｍＬ。于３６℃±１℃培养８ｈ～１８ｈ。７．３ 选择性增菌分别移取培养８ｈ～１８ｈ的悬液各１ｍＬ加入９ｍＬＥＥ增菌液中，３６℃±１℃培养１８ｈ～２４ｈ。７．４ 分离７．４．１ 在所有显示生长的试管或增菌液中用３ｍｍ接种环沾取一环，分别接种于伊红美兰琼脂及ＳＳ琼脂（或麦康凯琼脂）平板各一个，三区法或四区法划线，以得到单个菌落。平板于３６℃±１℃培养１８ｈ～２４ｈ。７．４．２ 上述平板上如出现可疑菌落，至少应挑取５个疑似菌落，进行传代培养。如果平板上的目标可疑菌落少于５个，则应该全部挑取传代培养。按７．５进行鉴定。变形杆菌在ＳＳ琼脂和麦康凯琼脂上的菌落呈圆形，扁平，无色至淡粉色，半透明，表面光滑；在伊红美兰琼脂上，菌落呈灰白色，圆形，光滑。７．５ 鉴定７．５．１ 革兰氏染色与镜检挑取可疑菌落涂片，进行革兰氏染色，镜检观察细菌形态。变形杆菌为革兰氏阴性杆菌，无芽孢、无荚膜、周生鞭毛、具运动性。７．５．２ 苯丙氨酸脱氨酶试验７．５．２．１ 挑取可疑菌落接种到苯丙氨酸琼脂斜面，３６℃±１℃培养１８ｈ～２４ｈ。滴加１０％三氯化铁溶液２滴～３滴，自斜面培养物上流下，苯丙氨酸脱氨酶阳性者呈棕黑色。７．５．２．２ 若挑取的可疑菌落苯丙氨酸脱氨酶均为阴性，则直接判定生化特性鉴定结果阴性。７．５．２．３ 若挑取的可疑菌落经涂片、染色和镜检为革兰氏染色阴性，且苯丙氨酸脱氨酶反应呈阳性，则按表１的生化试验进行细菌鉴定。也可以用ＡＰＩ２０Ｅ生化鉴定试剂盒或ＶＩＴＥＫ生化鉴定系统进行鉴定。表１ 变形杆菌有关细菌鉴别表种类普通变形杆菌奇异变形杆菌产粘变形杆菌彭氏变形杆菌摩根摩根氏菌产碱普罗菲登斯菌雷氏普罗菲登斯菌斯氏普罗菲登斯菌拉氏普罗菲登斯菌海氏普罗菲登斯菌苯丙氨酸脱氨酶＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋甘露糖发酵－－－－＋＋＋＋＋＋鸟氨酸脱羧酶－＋－－＋－－－－－麦芽糖发酵＋－＋＋－－－－－＋３犛犖／犜２５２４．２—２０１０食品伙伴网表１（续）种类普通变形杆菌奇异变形杆菌产粘变形杆菌彭氏变形杆菌摩根摩根氏菌产碱普罗菲登斯菌雷氏普罗菲登斯菌斯氏普罗菲登斯菌拉氏普罗菲登斯菌海氏普罗菲登斯菌吲哚产生＋－＋－＋＋＋＋＋－尿素酶＋＋＋＋＋－＋ｄ－－阿东醇发酵－－－－－＋＋－－＋肌醇发酵－－－－－－＋＋－ｄ木糖发酵＋＋－＋－－－－－－Ｈ２Ｓ产生＋＋－ｄ－－－－－－明胶液化（２２℃）＋＋＋ｄ－－－－－－ 注：＋，阳性；－，阴性；ｄ，可变。７．５．３ 生化特征普通变形杆菌、奇异变形杆菌、摩根摩根氏菌、产碱普罗威登斯菌与其他变形杆菌细菌的生化特征见表１。８ 报告结果根据每一稀释度证实生化特性鉴定结果为阳性的试管管数，查最可能数（ＭＰＮ）表（见附录Ｂ），报告每克（毫升）样品中变形杆菌的最近似数。４犛犖／犜２５２４．２—２０１０食品伙伴网附 录 犃（规范性附录）培养基与试剂犃．１ 缓冲蛋白胨水（犅犘犠）犃．１．１ 成分蛋白胨 １０．０ｇ氯化钠５．０ｇ磷酸氢二钠（含１２个结晶水）９．０ｇ磷酸二氢钾１．５ｇ蒸馏水１０００ｍＬ犃．１．２ 制法将各成分加入蒸馏水中，混匀，静置约１０ｍｉｎ，加热煮沸至完全溶解，调节ｐＨ至７．２±０．１，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ。犃．２ 肠杆菌增菌肉汤（犈犈肉汤）犃．２．１ 成分蛋白胨１０．０ｇ葡萄糖５．０ｇ磷酸氢二钠８．０ｇ磷酸二氢钾２．０ｇ牛胆盐２０．０ｇ煌绿０．０１５ｇ蒸馏水１０００ｍＬ犃．２．２ 制法应使用纯净的牛胆盐和煌绿，减少对受损伤且数量极少的肠杆菌的生长抑制。将各成分加入蒸馏水中，加热煮沸，分装每瓶９０ｍＬ。制成的培养基为绿色，可放置２℃～８℃冷藏柜保存，４周内使用。犃．３ 犛犛琼脂犃．３．１ 基础培养基犃．３．１．１ 组成牛肉膏５．０ｇ蛋白胨５．０ｇ三号胆盐３．５ｇ琼脂１７．０ｇ蒸馏水１０００ｍＬ犃．３．１．２ 制法按上述成分配好，加热使溶解，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ，保存备用。犃．３．２ 完全培养基犃．３．２．１ 组成基础培养基１０００ｍＬ５犛犖／犜２５２４．２—２０１０食品伙伴网乳糖１０．０ｇ柠檬酸钠８．５ｇ硫代硫酸钠８．５ｇ１０％柠檬酸铁溶液１０．０ｍＬ１％中性红溶液２．５ｍＬ０．１％煌绿溶液０．３３ｍＬ犃．３．２．２ 制法加热溶化基础培养基，按比例加入上述除染料以外之各成分，充分混合均匀，调节ｐＨ至７．０±０．２，加入中性红和煌绿溶液，倾注平板。注１：制好的培养基宜当日使用，或冷藏保存于冰箱内于４８ｈ内使用。注２：煌绿溶液配制好后应在１０ｄ内使用。注３：可以购用ＳＳ琼脂的干粉培养基。犃．４ 伊红美蓝琼脂（犈犕犅）犃．４．１ 组成蛋白胨１０．０ｇ乳糖１０．０ｇ磷酸氢二钾２．０ｇ琼脂１７．０ｇ２％伊红Ｙ溶液２０．０ｍＬ美蓝０．５％水溶液１３．０ｍＬ蒸馏水１０００ｍＬ犃．４．２ 制法将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，调节ｐＨ至７．１±０．２，分装于烧瓶内，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ，冷却至５０℃～５５℃，按无菌操作加入灭菌的乳糖、伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。犃．５ 麦康凯琼脂（犕犃犆）犃．５．１ 组成蛋白胨１７．０ｇ胨３．０ｇ猪胆盐（或牛、羊胆盐）５．０ｇ氯化钠５．０ｇ琼脂１７．０ｇ蒸馏水１０００ｍＬ乳糖１０．０ｇ０．０１％结晶紫水溶液１０．０ｍＬ０．５％中性红水溶液５．０ｍＬ犃．５．２ 制法除乳糖和指示液外，将其他成分配好，加热溶解，调节ｐＨ至７．２±０．２，分装于烧瓶内，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ，冷却至５０℃～５５℃，按无菌操作加入灭菌的乳糖、结晶紫和中性红水溶液，摇匀后倾注平板。结晶紫和中性红水溶液配好后应经高压灭菌。６犛犖／犜２５２４．２—２０１０食品伙伴网犃．６ 苯丙氨酸琼脂斜面犃．６．１ 组成酵母浸膏３．０ｇＤＬ苯丙氨酸２．０ｇ