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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２５２４．１—２０１０进出口食品中变形杆菌检测方法第１部分：定性检测方法犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犘狉狅狋犲犲犪犲狊狆犲犮犻犲狊犻狀犳狅狅犱犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋—犘犪狉狋１：犙狌犪犾犻狋犪狋犻狏犲犿犲狋犺狅犱２０１００３０２发布２０１００９１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布食品伙伴网书书书前 言 ＳＮ／Ｔ２５２４《进出口食品中变形杆菌检测方法》分为两部分：———第１部分：定性检测方法；———第２部分：ＭＰＮ方法。本部分为ＳＮ／Ｔ２５２４的第１部分。本部分的附录Ａ为规范性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局。本部分主要起草人：蒋鲁岩、郭桂萍、陈双雅、徐邦兴、高洁湘、蒋原、薛峰、祝长青、陈国强。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２５２４．１—２０１０食品伙伴网进出口食品中变形杆菌检测方法第１部分：定性检测方法１ 范围ＳＮ／Ｔ２５２４的本部分规定了乳与乳制品、肉与肉制品、水产品、蔬菜、蛋制品等５大类食品中变形杆菌的检测方法。本部分适用于食品中普通变形杆菌、奇异变形杆菌、摩根摩根氏菌、产碱普罗菲登斯菌的检测。２ 规范性引用文件下列文件中的条款通过ＳＮ／Ｔ２５２４的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。ＳＮ／Ｔ１５３８．１ 培养基制备指南 第１部分：实验室培养基制备质量保证通则ＳＮ／Ｔ１５３８．２ 培养基制备指南 第２部分：培养基性能测试实用指南３ 定义下列术语和定义适用于ＳＮ／Ｔ２５２４的本部分。３．１变形杆菌 犘狉狅狋犲狌狊变形杆菌簇（Ｐｒｏｔｅｅａｅ）的细菌统称为变形杆菌。它们是有动力的革兰氏阴性杆菌，分为三个独立的菌属，即变形杆菌属、摩根氏菌属和普罗菲登斯菌。目前报道的引起食物中毒的变形杆菌有普通变形杆菌、奇异变形杆菌、产碱普罗菲登斯菌和摩根摩根氏菌。４ 设备与材料４．１ 冰箱：－２０℃～４℃。４．２ 恒温培养箱：３６℃±１℃。４．３ 天平：０ｇ～５００ｇ，感量０．５ｇ。４．４ 均质器。４．５ 均质袋。４．６ 灭菌三角烧瓶：５００ｍＬ，２５０ｍＬ。４．７ 灭菌培养皿：直径９０ｃｍ。４．８ 显微镜：１０×～１００×。４．９ 灭菌刀、剪子、镊子。４．１０ 质控菌株：普通变形杆菌ＡＴＣＣ１３３１５Ｔ、奇异变形杆菌ＡＴＣＣ２９９０６Ｔ、摩根摩根氏菌ＡＴＣＣ２５８３０Ｔ、产碱普罗威登斯菌ＡＴＣＣ９８８６Ｔ或类似菌株。４．１１ ＡＰＩ２０Ｅ肠杆菌和其他革兰氏阴性杆菌鉴定试剂盒或类似产品。４．１２ ＶＩＴＥＫ全自动微生物分析系统或类似设备。１犛犖／犜２５２４．１—２０１０食品伙伴网５ 培养基及试剂５．１ 肠杆菌增菌肉汤（ＥＥ肉汤）：见附录Ａ中第Ａ．１章。５．２ 革兰氏阴性菌增菌液（ＧＮ增菌液）：见附录Ａ中第Ａ．２章。５．３ 沙门氏菌和志贺氏菌琼脂（ＳＳ琼脂）：见附录Ａ中第Ａ．３章。５．４ 伊红美兰琼脂（ＥＭＢ琼脂）：见附录Ａ中第Ａ．４章。５．５ 麦康凯琼脂（ＭＡＣ琼脂）：见附录Ａ中第Ａ．５章。５．６ 苯丙氨酸琼脂斜面：见附录Ａ中第Ａ．６章。５．７ 革兰氏染色液：见附录Ａ中第Ａ．７章。５．８ 培养基和试剂的配制遵循ＳＮ／Ｔ１５３８．１和ＳＮ／Ｔ１５３８．２的要求。６ 方法提要与流程６．１ 方法提要本方法采用增菌培养和分离鉴定的方法对变形杆菌进行定性检测。６．２ 检测流程检测流程图见图１。图１ 变形杆菌检测流程图２犛犖／犜２５２４．１—２０１０食品伙伴网７ 检测步骤７．１ 前增菌称取２５ｇ（ｍＬ）样品，放入盛有２２５ｍＬＢＰＷ的无菌均质杯中，以８０００ｒ／ｍｉｎ～１００００ｒ／ｍｉｎ均质１ｍｉｎ～２ｍｉｎ，或置于盛有２２５ｍＬＢＰＷ的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打１ｍｉｎ～２ｍｉｎ，若样品为液态，不需要均质，振荡均匀。如需要，测定ｐＨ值，用１ｍｏｌ／Ｌ无菌氢氧化钠或盐酸调ｐＨ值至６．８±０．２。无菌操作，将样品转至５００ｍＬ锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于３６℃±１℃培养８ｈ～１８ｈ。如为冷冻样品，应在４５℃以下不超过１５ｍｉｎ，或２℃～５℃不超过１８ｈ解冻。７．２ 增菌轻轻摇动培养过的样品混合物，移取１ｍＬ，转种于１０ｍＬＧＮ增菌液或ＥＥ肉汤内，于３６℃±１℃培养１８ｈ～２４ｈ。７．３ 分离以接种环取增菌液一环，划线接种于ＥＭＢ琼脂平板和ＳＳ琼脂平板（或ＭＡＣ琼脂），于３６℃±１℃分别培养１８ｈ～２４ｈ。变形杆菌在ＥＭＢ琼脂上，菌落呈灰白色，圆形，光滑；在ＳＳ琼脂和ＭＡＣ琼脂上的菌落呈圆形，扁平，无色至淡粉色，半透明，表面光滑。７．４ 鉴定７．４．１ 革兰氏染色与镜检挑取可疑菌落涂片，进行革兰氏染色，镜检观察细菌形态。变形杆菌为革兰氏阴性杆菌，无芽孢、无荚膜、周生鞭毛、具运动性。７．４．２ 苯丙氨酸脱氨酶试验挑取可疑菌落接种到苯丙氨酸琼脂斜面，３６℃±１℃培养６ｈ～８ｈ或１８ｈ～２４ｈ。滴加１０％三氯化铁溶液２滴～３滴，自斜面培养物上流下，苯丙氨酸脱氨酶阳性者呈棕黑色。若挑取的可疑菌落苯丙氨酸脱氨酶均为阴性，则直接判定生化特性鉴定结果阴性，按第８章报告结果。若挑取的可疑菌落经涂片、染色和镜检为革兰氏染色阴性，且苯丙氨酸脱氨酶反应呈阳性，应进一步生化鉴定或用ＡＰＩ２０Ｅ生化鉴定试剂盒、ＶＩＴＥＫ生化鉴定系统进行鉴定。７．４．３ 生化特征普通变形杆菌、奇异变形杆菌、摩根摩根氏菌、产碱普罗威登斯菌生化特征见表１。表１ 变形杆菌有关细菌鉴别表种 类普通变形杆菌奇异变形杆菌摩根摩根氏菌产碱普罗菲登斯菌苯丙氨酸脱氨酶＋＋＋＋甘露糖醇发酵——＋＋鸟氨酸脱羧酶—＋＋—麦芽糖发酵＋———吲哚产生＋—＋＋尿素酶＋＋＋—阿东醇发酵———＋肌醇发酵————木糖发酵＋＋——Ｈ２Ｓ产生＋＋／（＋）——西蒙氏柠檬酸盐ｄ＋＋—明胶液化（２２℃）＋＋—— 注：＋阳性；－阴性；＋／（＋）大部分菌株阳性，有少数菌株迟缓阳性；ｄ有不同的反应。３犛犖／犜２５２４．１—２０１０食品伙伴网８ 报告结果生化特性鉴定结果为阳性，则报告每２５ｇ样品中检出何种变形杆菌；若为阴性，则报告每２５ｇ样品中未检出变形杆菌。４犛犖／犜２５２４．１—２０１０食品伙伴网附 录 犃（规范性附录）培养基与试剂犃．１ 犈犈肉汤犃．１．１ 成分蛋白胨 １０．０ｇ葡萄糖５．０ｇ磷酸氢二钠８．０ｇ磷酸二氢钾２．０ｇ牛胆盐２０．０ｇ煌绿０．０１５ｇ蒸馏水１０００ｍＬ犃．１．２ 制法应使用纯净的牛胆盐和煌绿，减少对受损伤且数量极少的肠杆菌的生长抑制。将各成分加入蒸馏水中，加热煮沸，分装每瓶９０ｍＬ。制成的培养基为绿色，可放置２℃～８℃冷藏柜保存，４周内使用。犃．２ 犌犖增菌液犃．２．１ 成分胰蛋白胨２０．０ｇ葡萄糖１．０ｇ甘露醇２．０ｇ柠檬酸钠５．０ｇ去氧胆酸钠０．５ｇ磷酸氢二钾４．０ｇ磷酸二氢钾１．５ｇ蒸馏水１０００ｍＬ犃．２．２ 制法按上述成分配好，加热使溶解，校正ｐＨ。分装每瓶２２５ｍＬ，１１５℃灭菌１５ｍｉｎ，备用。犃．３ 犛犛琼脂犃．３．１ 基础培养基犃．３．１．１ 组成牛肉膏５．０ｇ蛋白胨５．０ｇ三号胆盐３．５ｇ琼脂１７．０ｇ蒸馏水１０００ｍＬ犃．３．１．２ 制法按上述成分配好，加热使溶解，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ，保存备用。５犛犖／犜２５２４．１—２０１０食品伙伴网犃．３．２ 完全培养基犃．３．２．１ 组成基础培养基１０００ｍＬ乳糖１０．０ｇ柠檬酸钠８．５ｇ硫代硫酸钠８．５ｇ１０％柠檬酸铁溶液１０．０ｍＬ１％中性红溶液２．５ｍＬ０．１％煌绿溶液０．３３ｍＬ犃．３．２．２ 制法加热溶化基础培养基，按比例加入上述除染料以外之各成分，充分混合均匀，调节ｐＨ至７．０±０．２，加入中性红和煌绿溶液，倾注平板。注１：制好的培养基宜当日使用，或冷藏保存于冰箱内于４８ｈ内使用。注２：煌绿溶液配制好后应在１０ｄ内使用。注３：可以购用ＳＳ琼脂的干粉培养基。犃．４ 犈犕犅琼脂犃．４．１ 组成蛋白胨１０．０ｇ乳糖１０．０ｇ磷酸氢二钾２．０ｇ琼脂１７．０ｇ２％伊红Ｙ溶液２０．０ｍＬ美蓝０．５％水溶液１３．０ｍＬ蒸馏水１０００ｍＬ犃．４．２ 制法将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，调节ｐＨ至７．１±０．２，分装于烧瓶内，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ，冷却至５０℃～５５℃，按无菌操作加入灭菌的乳糖、伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。犃．５ 犕犃犆琼脂犃．５．１ 组成蛋白胨１７．０ｇ胨３．０ｇ猪胆盐（或牛、羊胆盐）５．０ｇ氯化钠５．０ｇ琼脂１７．０ｇ蒸馏水１０００ｍＬ乳糖１０．０ｇ０．０１％结晶紫水溶液１０．０ｍＬ０．５％中性红水溶液５．０ｍＬ犃．５．２ 制法除乳糖和指示液外，将其他成分配好，加热溶解，调节ｐＨ至７．２±０．２，分装于烧瓶内，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ，冷却至５０℃～５５℃，按无菌操作加入灭菌的乳糖、结晶紫和中性红水溶液，摇匀后倾注６犛犖／犜２５２４．１—２０１０食品伙伴网平板。结晶紫和中性红水溶液配好后应经高压灭菌。犃．６ 苯丙氨酸琼脂斜面犃．６．１ 组成酵母浸膏３．０ｇＤＬ苯丙氨酸２．０ｇ磷酸氢二钠１．０ｇ氯化钠５．０ｇ琼脂１２．０ｇ蒸馏水１０００ｍＬ犃．６．２ 制法将各成分加热煮沸，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ，分装斜面。犃．７ 革兰氏染色法犃．７．１ 结晶紫染色液结晶紫１．０ｇ９５％乙醇２０ｍＬ１％草酸铵水溶液８０ｍＬ将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。犃．７．２ 革兰氏碘液碘１．０ｇ碘化钾２．０ｇ蒸馏水３００ｍＬ将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，完全溶解后，再加蒸馏水３００ｍＬ。犃．７．３ 复染液沙黄０．２５ｇ９５％乙醇１０ｍＬ蒸馏水９０ｍＬ将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。犃．７．４ 染色法犃．７．４．１ 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染１ｍｉｎ，水洗。犃．７．４．２ 滴加革兰氏碘液，作用１ｍｉｎ，水洗。犃．７．４．３ 滴加９５％乙醇脱色，约３０ｓ；或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色１０ｓ。犃．７．４．４ 水洗，滴加复染液，复染１ｍｉｎ，水洗，待干，镜检。犃．７．４．５ 结果革兰氏阳性菌呈紫色。革兰氏阴性菌呈红色。注１：亦可用１∶１０稀释石炭酸复红染色液作复染液，复染时间仅需１０ｓ。注２：本方法中使用的所有培养基有市售的半成品和成品，可选择使用干燥培养基。注３：由法国生物梅里埃公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。犛犖／犜２５２４．１—２０１０食品伙伴网书书书０１０２—１４２５２犜／犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准进出口食品中变形杆菌检测方法第１部分：定性检测方法ＳＮ／Ｔ２５２４．１—２０１０中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６ ６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６ 印张０．７５ 字数１４千字２０１０年５月第一版 ２０１０年５月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２０８５０ 定价１６．００元食品伙伴网