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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２５１５—２０１０牛结节疹检疫技术规范犘狉狅狋狅犮狅犾狅犳狇狌犪狉犪狀狋犻狀犲犳狅狉犾狌犿狆狔狊犽犻狀犱犻狊犲犪狊犲２０１００３０２发布２０１００９１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准牛结节疹检疫技术规范ＳＮ／Ｔ２５１５—２０１０中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６ ６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６ 印张０．７５ 字数１５千字２０１０年５月第一版 ２０１０年５月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２０８２８ 定价１６．００元书书书前 言本标准的附录Ａ为规范性附录、附录Ｂ为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：邱杨、鱼海琼、林志雄、唐丽霞、赵丽、李艳霞、黄名秋。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２５１５—２０１０牛结节疹检疫技术规范１ 范围本标准规定了牛结节疹电镜观察、病毒分离、血清中和试验等诊断方法。本标准适用于牛结节疹的检疫。２ 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法３ 缩略语下列缩略词适用于本标准。３．１ＬＳＤ：牛结节疹。３．２ＥＤＴＡ：乙二胺四乙酸。３．３ＧＭＥＭ：Ｇｌａｓｇｏｗ改良Ｅａｇｌｅ’ｓ培养基。３．４ＣＰＥ：致细胞病变作用。３．５Ｈ＆Ｅ：苏木精伊红染色。３．６ＬＴ：羔羊睾丸。３．７ＰＢＳ：磷酸盐缓冲液。３．８ＮＢ：营养肉汤。３．９ＢＨＫ２１：幼仓鼠肾细胞。３．１０ＢＥＫ：牛肾细胞。３．１１Ｖｅｒｏ：非洲绿猴肾细胞。４ 试剂和材料４．１ 三蒸水应符合ＧＢ／Ｔ６６８２要求。４．２ 肝素或ＥＤＴＡ。１犛犖／犜２５１５—２０１０４．３ １０％福尔马林。４．４ 含抗生素的ＰＢＳ缓冲液（ｐＨ７．２）：配制方法见附录Ａ。４．５ ＧＭＥＭ。４．６ 无水丙酮。４．７ 石蜡膜或蜡板。４．８ ｐＨ７．８ＴｒｉｓＥＤＴＡ缓冲液：配制方法见附录Ａ。４．９ ｐＨ７．８，１％磷钨酸：配制方法见附录Ａ。４．１０ 牛结节疹病毒Ｎｅｅｔｈｌｉｎｇ毒株。４．１１ 原代或次代ＬＴ细胞。４．１２ 采用ＭＥＭ培养液，加１０％犊牛血清，２％水解乳蛋白，１００μｇ／ｍＬ青霉素，１００μｇ／ｍＬ链霉素，１００μｇ／ｍＬ制霉菌素。４．１３ 待检血清：无菌静脉采血，分离血清，并于５６℃灭活３０ｍｉｎ。４．１４ 阳性血清：同毒株来源。４．１５ 阴性血清：阴性牛场健康牛血清。５ 器材和设备５．１ 解剖镜。５．２ 水浴锅。５．３ 恒温箱。５．４ 普通冰箱和超低温冰箱。５．５ 台式离心机。５．６ 细胞培养板。５．７ 细胞培养箱。５．８ 二氧化碳培养箱。５．９ ２０μＬ～２００μＬ微量移液器。５．１０ 倒置显微镜。５．１１ 电子显微镜。６ 电镜观察６．１ 取新鲜的皮肤结节，制备组织悬液，用透射电镜观察。方法是：取一滴悬液于石蜡膜或蜡板上，将４００目六角形电子显微镜网格浮在其上，该网格具有绒毛状碳基质并在戊胺蒸气经光激活用。１ｍｉｎ后，将网栅转移到一滴ｐＨ７．８ＴｒｉｓＥＤＴＡ缓冲液中２０ｓ，然后，转到一滴ｐＨ７．８，１％的磷钨酸中，１０ｓ。用滤纸吸去水分，空干，置于电子显微镜下观察。山羊痘病毒粒子如砖状，周围覆盖有短管状结构，大小约为（２９０×２７０）ｎｍ，有些病毒粒子周围有宿主细胞膜包围，因此需尽可能多观察以确认病毒形态。６．２ 在电镜下，山羊痘病毒很难与正痘病毒区别，且其形态学上与牛痘和痘病毒没有区别，但牛很少发生痘病毒和牛痘病毒感染，也不引起全身性感染，其他正痘病毒则均不引起牛发病。而副痘病毒在电镜下其形态小于痘病毒，呈卵圆形，外面有单个连续管状结构，像沟槽覆盖在病毒粒子周围，能与牛型山羊痘病毒区分开来。７ 病毒分离试验７．１ 样品的采集、送检和制备７．１．１ 血液样品的采集与制备在ＬＳＤ病毒血症期出现全身病灶之前或４ｄ内，采集血液，加入肝素或ＥＤＴＡ抗凝（用于病毒分离２犛犖／犜２５１５—２０１０的加有抗凝剂的血液样品应立即放置在冰浴上，最好尽快处理。样品在处理前４℃可放置２ｄ，但不宜冷冻或常温保存）。将抗凝血液以２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，小心吸取上清液中含病毒的血沉棕黄层，无菌移入５ｍＬ冷双蒸水中，３０ｓ后，加入５ｍＬ冷的双倍浓度的生长培养基，如ＧＭＥＭ进行混合，混合物２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，弃上清液，收集血沉棕黄层移入到５ｍＬ生长培养基中，还可再离洗一遍用于病毒培养。７．１．２ 病灶组织样品的采集与制备病毒分离和抗原检测材料在尸体解剖时采集，包括：皮肤结节、肺病灶，或淋巴结及病灶周围的组织。采集的时间以临床症状出现后，中和抗体出现前的第一周内为宜。采集的样品应立即放进１０倍体积的１０％福尔马林中，置４℃冰浴或－２０℃保存。如果样品没有冷藏条件需要运送，应加入含有１０％甘油的运输液，样品块应足够大，以避免运输液渗到组织当中。将病灶材料无菌制成匀浆，加入到等体积含复合抗生素的ＰＢＳ缓冲液中，继续研磨，逐渐制成１０％～２０％的组织悬液。冻融３次，８０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，取上清液于５ｍＬ的生长培养基中，可用于病毒培养。７．２ 病毒分离培养及鉴定７．２．１ 病毒分离培养分离该病毒多以ＬＴ细胞最为敏感。取上述用于病毒培养的培养液１ｍＬ接入己生长好的ＬＴ细胞培养瓶中，置３７℃吸附１ｈ后，用温ＰＢＳ洗去培养液，再加１０ｍＬ细胞培养液培养。也可用含有ＬＴ细胞和飞片的组织培养管，或者感染的组织培养显微镜载玻片。连续１４ｄ观察培养瓶的ＣＰＥ，如果培养液混浊更换培养液。其ＣＰＥ特征是细胞膜皱缩到细胞圆缩，核染色体边缘化。最初看到小面积的ＣＰＥ，４ｄ～６ｄ波及整个细胞层。１４ｄ后如未发现ＣＰＥ，培养物应该冻融３次，取上清液接种新鲜的ＬＴ细胞并做二次培养。如出现ＣＰＥ征兆或感染飞片出现ＣＰＥ，则进行特异性鉴定。７．２．２ 鉴定取上述培养物用丙酮固定，以Ｈ＆Ｅ染色。由于山羊痘病毒在细胞内产生特异性的ＣＰＥ和胞浆内包涵体，所以当看到相当于细胞核的一半、大小不一、且周边有清晰晕的呈亮红色嗜酸性细胞浆内包涵体，即可诊断为痘病毒感染。８ 血清学中和试验８．１ 细胞株ＬＳＤ病毒可以用牛、绵羊或山羊的组织细胞进行培养，如能在羔羊及犊牛的肾或睾丸细胞、绵羊胚胎的肾和肺细胞、鸡胚成纤维细胞等原代细胞以及ＢＥＫ、Ｖｅｒｏ和ＢＨＫ２１等传代细胞中增殖并产生病变，而以ＬＴ细胞较为敏感，尤以毛用绵羊羔睾丸细胞最为敏感。８．２ 标准毒株山羊痘病毒标准株，通常是在组织培养中生长良好的疫苗株，滴度大于ｌｏｇ１０６ＴＣＩＤ５０／ｍＬ。目前国际上已有两株山羊痘病毒疫苗株。一株为在ＬＴ或胎牛肌细胞上传１８代的肯尼亚绵羊痘和山羊痘病毒，另一株来自南非，此株已在羔羊肾细胞上传６０代和在鸡胚绒毛尿囊膜上传２０代。鉴于山羊痘病毒对组织培养敏感性不同的特性，因此，推荐使用肯尼亚标准毒株及对本病毒较敏感的原代或次代ＬＴ细胞，以确保中和试验结果的一致性。８．３ 犔犛犇微量血清中和试验程序８．３．１ 步骤８．３．１．１ 用９６孔微量细胞培养板。将待检血清作１∶５稀释。取培养液１６０μＬ加入第一、第四、第七和第十纵列各孔内，取一份待检血清４０μＬ加入第一排（横排，下同）的第１孔内，稀释后各吸取５０μＬ至同排的第２、第３孔内。取另一份待检血清４０μＬ加入第二排的第１孔内，稀释后各吸取５０μＬ至同排的第２、第３孔内。依次类推稀释各待检血清。每份血清均滴定３孔，第１孔为待检血清毒性对照（即第一、四、七、十纵列各孔为待检血清毒性对照孔，不加工作病毒抗原），后两孔为滴定试验孔。３犛犖／犜２５１５—２０１０８．３．１．２ 用培养液稀释病毒至１００ＴＣＩＤ５０／５０μＬ。加入５０μＬ工作病毒抗原置滴定试验孔中。每一块９６孔培养板可检验３２份血清。８．３．１．３ 将培养板置５％的二氧化碳培养箱３７℃感作１ｈ。８．３．１．４ 每孔加已培养好的３×１０５ｍＬ细胞悬液１００μＬ。８．３．１．５ 置３７℃二氧化碳培养箱进行培养９ｄ，连续观察ＣＰＥ。８．３．１．６ 同时做病毒回归试验以测定病毒实际ＴＣＩＤ５０。８．３．２ 对照８．３．２．１ 阳性血清和阴性血清均按被检血清进行。８．３．２．２ 病毒回归试验，即重新测定病毒的ＴＣＩＤ５０。将病毒抗原做１０倍系列稀释至１０－８，每个稀释度加４孔，每孔加５０μＬ，补加５０μＬ培养液，再加入细胞悬液１００μＬ，计算试验所用５０μＬ病毒液含有实际的ＴＣＩＤ５０。８．３．３ 结果判定８．３．３．１ 用倒置显微镜从第４大起每天观察细胞ＣＰＥ变化，当病毒抗原对照、阴性血清对照均出现ＣＰＥ、阳性血清对照无ＣＰＥ，待检血清对细胞无毒性，对照细胞生长正常，抗原实际用量在５０ＴＣＩＤ５０／５０μＬ～１５０ＴＣＩＤ５０／５０μＬ范围内方能判定结果，第９天终判，抗体效价滴定判读标准是以待检血清最高稀释度５０％保护为该待检血清的中和效价，以能保护细胞免于破坏的血清最高稀释度为该血清滴度。 ８．３．３．２ 中和滴度大于等于１∶５为阳性，小于１∶５为阴性。８．３．３．３ 每次试验中，阳性对照血清滴度不应比其已知效价差１个滴度以上，回归滴度变化应在５０ＴＣＩＤ５０～１５０ＴＣＩＤ５０之间。８．３．４ 结果解释通常血清中和试验是最特异的血清学试验方法，但ＬＳＤ感染后主要是细胞免疫，阴性结果免疫应答较温和，并非意味着动物没有产生抗体，而动物感染ＬＳＤ病毒仅产生低水平的中和抗体，因而不够敏感。因此在采用中和试验结果的同时，结合临床症状（参见附录Ｂ）等方法做最终判定。４犛犖／犜２５１５—２０１０附 录 犃（规范性附录）试剂配制犃．１ 肝素１２５ＩＵ／ｍＬ血液终浓度封管。犃．２ 犈犇犜犃ＥＤＴＡ用量为１．５ｍｇ／ｍＬ～２．５ｍｇ／ｍＬ血液终浓度。ＥＤＴＡ母液需分装，高压灭菌，４℃保存。犃．３ １０％甘油运输液Ｈａｎｋ’ｓ平衡盐１０倍浓缩液氯化钠（ＮａＣｌ） ８０ｇ氯化钾（ＫＣｌ） ４．０ｇ硫酸镁（ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ）１．０ｇ氯化镁（ＭｇＣｌ２·６Ｈ２Ｏ）１．０ｇ氯化钙（ＣａＣｌ２）１．４ｇ葡萄糖１０ｇ双蒸水８００ｍＬ配制方法：依照上列顺序称取各试剂，并依次溶解于双蒸水中，定容至１０００ｍＬ，分装，高压灭菌，贮存于室温或４℃。使用前，取Ｈａｎｋ’ｓ平衡盐１０倍浓缩液，用灭菌双蒸水稀释至工作液，并含复合抗生素及１０％甘油，即为１０％甘油运输液。犃．４ 狆犎７．０磷酸盐缓冲液（犘犅犛）的配制Ａ液氯化钠（ＮａＣｌ） ８．０ｇ氯化钾（ＫＣｌ）０．２ｇ氯化钙（ＣａＣｌ２·２Ｈ２Ｏ）０．１３２ｇ氯化镁（ＭｇＣｌ２·２Ｈ２Ｏ）０．１ｇ双蒸水１００ｍＬＢ液磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４）１．１５ｇ磷酸二氢钾（ＫＨ２ＰＯ４）０．２ｇ双蒸水２００ｍＬ依次称取各试剂并依次溶解在双蒸水中。以０．１０４ＭＰａ～０．１１２ＭＰａ１５ｍｉｎ高压灭菌Ａ液和Ｂ液。冷却后，将Ｂ液缓慢倒入Ａ液中搅拌均匀。分装于５００ｍＬ～１０００ｍＬ灭菌瓶中。取１ｍＬ～５ｍＬ接于ＮＢ（营养肉汤）中进行无菌检验。５犛犖／犜２５１５—２０１０贮存于４℃或室温。犃．５ 复合抗生素青霉素钠盐，每毫升含１０００国际单位（ＩＵ／ｍＬ），硫酸链霉素１ｍｇ／ｍＬ，制霉菌素１００ＩＵ／ｍＬ，或两性霉素２．５μｇ／ｍＬ和新霉素２００ＩＵ／ｍＬ。犃．６ 苏木精伊红染色苏木精１ｇ氧化汞０．５ｇ乙醇１０ｍＬ硫酸铝钾（或硫酸铝铵）２０ｇ去离子水２００ｍＬ犃．６．１ 配制ａ） 在酒精内溶解苏木精，在水内溶解硫酸铝钾，加热助溶；ｂ） 混合苏木精