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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２４９７．２８—２０１０进出口危险化学品安全试验方法第２８部分：穿梭质粒在突变检验中的应用犜犲狊狋犿犲狋犺狅犱狅犳犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋犱犪狀犵犲狉狅狌狊犮犺犲犿犻犮犪犾狊—犘犪狉狋２８：犛犺狌狋狋犾犲狏犲犮狋狅狉犳狌狀犮狋犻狅狀犻狀犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犿狌狋犪犵犲狀犲狊犻狊２０１００３０２发布２０１００９１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 ＳＮ／Ｔ２４９７《进出口危险化学品安全试验方法》系列标准共分为２９部分：———第１部分：体内哺乳动物肝细胞程序外ＤＮＡ合成（ＵＤＳ）试验；———第２部分：空斑形成细胞（ＰＦＣ）试验；———第３部分：大型溞繁殖试验；———第４部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验；———第５部分：睾丸细胞ＵＤＳ试验；———第６部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验；———第７部分：小鼠耳肿胀试验；———第８部分：腘窝淋巴结试验；———第９部分：血清溶血素测定试验；———第１０部分：Ｔ淋巴细胞增殖功能测定试验；———第１１部分：种系突变试验；———第１２部分：单细胞凝胶电泳分析试验；———第１３部分：荧光原位杂交试验；———第１４部分：ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳试验；———第１５部分：ＰＣＲＳＳＣＰ实验；———第１６部分：ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ实验；———第１７部分：哺乳动物行为毒理学试验；———第１８部分：ＤＮＡ加合物的检测方法；———第１９部分：ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ实验；———第２０部分：Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定蛋白质含量；———第２１部分：琼脂糖凝胶电泳试验；———第２２部分：ＤＮＡ的Ｔｍ值测定方法；———第２３部分：细胞器的分离实验方法；———第２４部分：细胞免疫功能体外检测方法；———第２５部分：体液免疫功能试验；———第２６部分：巨噬细胞功能试验；———第２７部分：流式细胞术检测凋亡；———第２８部分：穿梭质粒在突变检验中的应用；———第２９部分：生化需氧量（ＢＯＤ）测定。本部分为ＳＮ／Ｔ２４９７系列标准的第２８部分。本部分修改采用《分子克隆》中的相关的检测方法，其有关技术内容与上述方法完全一致，在标准文本格式上按ＧＢ／Ｔ１．１做了编辑性修改。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分负责起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国湖南出入境检验检疫局。本部分主要起草人：冯智劼、王利兵、王华、张园、向雪洁、赵好力宝。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２４９７．２８—２０１０进出口危险化学品安全试验方法第２８部分：穿梭质粒在突变检验中的应用１ 范围ＳＮ／Ｔ２４９７的本部分规定了进出口危险化学品安全试验中穿梭质粒在突变检验中的应用技术的术语和定义、试验原理、试验方法和试验结果。本部分适用于进出口危险化学品安全试验中的致突变性检测。２ 规范性引用文件下列文件中的条款通过ＳＮ／Ｔ２４９７的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。《分子克隆》３ 术语和定义下列术语和定义适用于本部分。３．１穿梭质粒 狊犺狌狋狋犾犲狏犲犮狋狅狉穿梭质粒是既能依靠质粒基因组在原核细胞中繁殖，又能依靠病毒基因组在真核细胞中复制的一类质粒。３．２靶基因 狋犪狉犵犲狋犵犲狀犲是诱变剂在哺乳动物细胞中作用的靶子，有时又是赋予细胞某种生物特征的选择基因。３．３ 转化 狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀将ＤＮＡ导入大肠杆菌或酵母细胞，并稳定地整合于基因组中，从而使受体细胞发生永生化改变的现象。３．４ 转染 狋狉犪狀狊犳犲犮狋犻狅狀病毒ＤＮＡ或ＲＮＡ导入感受态大肠杆菌的过程。也指将任何ＤＮＡ（包括质粒ＤＮＡ）或ＲＮＡ导入受体细胞的过程。４ 试验原理穿梭质粒除了含有在真核和原核细胞中复制的起点外，穿梭质粒带有对突变敏感的靶基因，将诱变剂处理的质粒转染哺乳动物细胞或先转染细胞后经诱变剂处理，在细胞内修复和复制后，回收质粒转化宿主菌，在一定条件下筛选突变子，并进一步对突变子靶基因测序以分析突变的位点、类型、序列特异性等信息，从而研究诱变剂的诱变机制。由于诱变是在哺乳动物细胞内发生的，因而能够较真实地反映高等动物的诱变机制；且诱变的发生通过宿主菌显色反应来显示，其任一位置发生的单碱基置换都能从表１犛犖／犜２４９７．２８—２０１０型改变表现出来；进一步对突变子靶基因进行序列分析，使表型的改变在ＤＮＡ分子水平上得到证明，敏感性极高。５ 试验方法５．１ 试剂耗材———细胞、质粒及其宿主细菌可根据试验目的进行选择。———选择剂可根据试验目的和质粒上的选择基因进行选择，如Ａｍｐ、Ｇ４１８等。———显色剂，需要根据试验目的选择。常用的有：Ｘｇａｌ（５溴４氯３吲哚βＤ半乳糖苷）、ＩＰＴＧ（异丙基βＤ硫代半乳糖苷）。———基因工程所需的各种试剂和酶。５．２ 受试物溶液试验所需各个浓度受试液通过稀释受试物储备液所得。储备液的配置应采用机械方法（如搅拌或超声）进行充分溶解。可采用饱和度值（溶解度值）来得到合适浓度的储备液。可使用助溶剂或分散剂。相应的溶剂对照组不能引起突变。５．３ 试验步骤５．３．１ 重组质粒的构建鉴定ＤＮＡ操作质粒提取、酶切、ＤＮＡ连接、重组质粒转化等均按《分子克隆》进行。转化到细菌中的重组质粒经选择基因的筛选，随机挑选其单菌落进行ＰＣＲ鉴定和核苷酸序列测定。５．３．２ 染毒和转染转染前一天接种５×１０５个细胞于２５ｃｍ培养瓶中，用不含双抗的ＤＭＥＭ培养基常规培养使细胞密度达７０％～９０％备用；于细胞体外直接将不同剂量的受试物溶液３７℃作用质粒一段时间（根据质粒的性质选择作用时间）。需设立对照组。将染毒后的质粒转染至目的细胞。具体方法可根据试验目的选择，详细方法可按照《分子克隆》进行。然后将转染后的细胞置于含１０％小牛血清的ＤＭＥＭ培养基中常规培养４８ｈ～７２ｈ后收获质粒。５．３．３ 细胞内染毒将已经转染了质粒的细胞进行培养，当细胞密度达到７０％～９０％时加入不同剂量的受试物溶液，避光培养２４ｈ～４８ｈ，移去受试物溶液，开始收获质粒。５．３．４ 细胞内质粒犇犖犃的抽提可以根据实际情况选择抽提方法。此处介绍Ｈｉｒｔ法进行抽提。将转染后的细胞用５ｍＬＰＢＳ洗两遍，１５ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ，１０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ各５ｍＬ洗两遍。加裂解液（０．６％ＳＤＳ，１０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ）１ｍＬ／皿，将脱落的细胞移至ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管，加入５ｍｏｌＮａＣｌ使其终浓度为１ｍｏｌ／Ｌ，缓慢混匀，４℃放置８ｈ以上，４００００×犵离心３０ｍｉｎ，取上清液用酚氯仿抽提，乙醇沉淀，４００００×犵离心３０ｍｉｎ，ＴＥ（１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ，１０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ）溶解。５．３．５ 转染细菌将抽提的质粒转入宿主细菌，具体方法参见《分子克隆》。常用氯化钙法。５．４ 显色反应５．４．１ 涂板及培养将感受态细菌涂布于特定的培养基上，室温放置１０ｍｉｎ。３７℃培养１６ｈ～２４ｈ，计数转化子。５．４．２ 显色可以根据预先选好的显色方法，判断是否有突变。例如：采用含有Ｘｇａｌ、ＩＰＴＧ和抗性药物的ＬＢ培养基上野生菌落为蓝色，而突变型为白色。分别计数。５．４．３ 表型鉴定为了避免假阳性和假阴性，随机挑选野生型和突变型菌落，重复５．３，如果结果一致，则可以进一步２犛犖／犜２４９７．２８—２０１０验证试验结果。５．４．４ 用于筛选突变的穿梭质粒的条件———可以得到含有质粒的克隆细胞。———自身突变率小于１０４。———具有较多的转化子。６ 试验结果６．１ 观察结果观察结果可填入表１，受试物诱发穿梭质粒的突变频率，其中突变频率＝突变子／转化子表１ 受试物诱发穿梭质粒的突变频率组别转化子／个突变子／个突变频率对照剂量１剂量２剂量３６．２ 结果分析根据加入受试物后突变子的增减，判断受试物对质粒突变作用的影响。通过ｔ检验和方差分析等统计学方法，比较不同剂量之间的差异。犛犖／犜２４９７．２８—２０１０书书书０１０２—８２．７９４２犜／犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准进出口危险化学品安全试验方法第２８部分：穿梭质粒在突变检验中的应用ＳＮ／Ｔ２４９７．２８—２０１０中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６ ６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６ 印张０．５ 字数７千字２０１０年５月第一版 ２０１０年５月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２０９３４ 定价１４．００元