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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２４９７．１５—２０１０进出口危险化学品安全试验方法第１５部分：犘犆犚犛犛犆犘实验犜犲狊狋犿犲狋犺狅犱狅犳犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋犱犪狀犵犲狉狅狌狊犮犺犲犿犻犮犪犾狊—犘犪狉狋１５：犜犲狊狋狅犳犘犆犚犛犛犆犘２０１００３０２发布２０１００９１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 ＳＮ／Ｔ２４９７《进出口危险化学品安全试验方法》系列标准共分为２９部分：———第１部分：体内哺乳动物肝细胞程序外ＤＮＡ合成（ＵＤＳ）试验；———第２部分：空斑形成细胞（ＰＦＣ）试验；———第３部分：大型溞繁殖试验；———第４部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验；———第５部分：睾丸细胞ＵＤＳ试验；———第６部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验；———第７部分：小鼠耳肿胀试验；———第８部分：腘窝淋巴结试验；———第９部分：血清溶血素测定试验；———第１０部分：Ｔ淋巴细胞增殖功能测定试验；———第１１部分：种系突变试验；———第１２部分：单细胞凝胶电泳分析试验；———第１３部分：荧光原位杂交试验；———第１４部分：ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳试验；———第１５部分：ＰＣＲＳＳＣＰ实验；———第１６部分：ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ实验；———第１７部分：哺乳动物行为毒理学试验；———第１８部分：ＤＮＡ加合物的检测方法；———第１９部分：ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ实验；———第２０部分：Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定蛋白质含量；———第２１部分：琼脂糖凝胶电泳试验；———第２２部分：ＤＮＡ的Ｔｍ值测定方法；———第２３部分：细胞器的分离实验方法；———第２４部分：细胞免疫功能体外检测方法；———第２５部分：体液免疫功能试验；———第２６部分：巨噬细胞功能试验；———第２７部分：流式细胞术检测凋亡；———第２８部分：穿梭质粒在突变检验中的应用；———第２９部分：生化需氧量（ＢＯＤ）测定。本部分为ＳＮ／Ｔ２４９７系列标准的第１５部分。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分负责起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国湖南出入境检验检疫局。本部分主要起草人：于艳军、王利兵、王华、陈春、李学洋、赵黎华。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２４９７．１５—２０１０进出口危险化学品安全试验方法第１５部分：犘犆犚犛犛犆犘实验１ 范围ＳＮ／Ｔ２４９７的本部分规定了进出口危险化学品ＰＣＲＳＳＣＰ实验的主要试剂和材料、主要仪器设备、试验步骤和试验结果。本部分适用于可能引起ＤＮＡ片段中碱基突变的进出口危险化学品的筛查。２ 术语、定义和缩略语２．１ 术语和定义下列术语和定义适用于本部分。２．１．１ 基因突变 犵犲狀犲犿狌狋犪狋犻狅狀由于ＤＮＡ分子中发生碱基对的增添、缺失或改变而引起的基因结构的改变。２．２ 缩略语下列缩略语适用于本部分。２．２．１ＰＣＲ 聚合酶链式反应２．２．２ ＳＳＣＰ 单链构象多态性２．２．３ＴＥＭＥＤＮ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′四甲基乙二胺３ 原理单链ＤＮＡ片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链ＤＮＡ分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同。因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开。该方法为单链构象多态性分析。将ＳＳＣＰ用于检查ＰＣＲ扩增产物的基因突变，即为ＰＣＲＳＳＣＰ技术。４ 试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水为灭菌蒸馏水或超纯水。４．１ ３０％丙烯酰胺：丙烯酰胺２９ｇ，Ｎ，Ｎ′亚甲双丙烯酰胺１ｇ，加蒸馏水至６０ｍＬ，加热至３７℃溶解，补加水至终体积为１００ｍＬ，过滤除菌。４．２ ５×ＴＢＥ：５４ｇＴｒｉｓ碱，２７．５ｇ硼酸，２０ｍＬ０．５ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，调节ｐＨ值至８．０。４．３ １０％过硫酸铵：１ｇ过硫酸铵溶于１０ｍＬ水中，４℃保存数周。４．４ ＴＥＭＥＤ。４．５ ６×上样缓冲液：０．２５％溴酚蓝，０．２５％二甲苯青ＦＦ，３０％甘油水溶液，４℃保存。１犛犖／犜２４９７．１５—２０１０５ 仪器设备５．１ 电泳仪。５．２ 聚丙烯凝胶电泳槽。６ 试验步骤６．１ 犘犆犚反应液总体积为１０μＬ，在ＰＣＲ管中加入下列反应成分：ａ） １０×Ｂｕｆｆｅｒ１μＬ；ｂ） ｄＮＴＰ７０μｍｏｌ／Ｌ；ｃ） ＤＮＡ模板１００ｎｇ。引物及ＴａｑＤＮＡ聚合酶依实验设计要求按比例加入：ａ） ａ３２ＰｄＣＴＰ０．１μＬ（１μＣｉ）；ｂ） 加ｄｄＨ２Ｏ至１０μＬ。按实验设计循环参数进行扩增，获取扩增产物。６．２ 聚丙烯酰胺凝胶制备根据分离的ＤＮＡ片段的大小不同，按表１和表２配制不同浓度的丙烯酰胺凝胶溶液。每１００ｍＬ丙烯酰胺凝胶溶液加３５μＬＴＥＭＥＤ，混匀，立即铺胶，插入梳子，于室温聚合６０ｍｉｎ。表１ 犇犖犃在聚丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围丙烯酰胺含量／％有效分离范围／ｂｐ３．５１０００～２０００５．０８０～５００８．０６０～４００１２．０４０～２００１５．０２５～１５０２０．０６～１００表２ 制备聚丙烯酰胺凝胶所用试剂的体积试剂制备不同浓度凝胶所用试剂／ｍＬ３．５％５．０％８．０％１２．０％２０．０％３０％丙烯酰胺１１．６１６．６２６．６４０．０６６．６水６７．７６２．７５２．７３９．３１２．７５×ＴＢＥ２０．０２０．０２０．０２０．０２０．０１０％过硫酸铵０．７０．７０．７０．７０．７６．３ 上样小心取出梳子，用水冲洗加样孔。取１０μＬ的ＰＣＲ产物，加适量上样缓冲液混合后，煮沸变性１０ｍｉｎ，立即冰浴，上样。６．４ 电泳接上电极，（１～８）Ｖ／ｃｍ的电压下进行电泳。电泳至标准参照染料迁移至所需位置，停止电泳。６．５ 犇犖犃的检测６．５．１ 溴化乙锭染色将凝胶浸在含０．５μｇ／ｍＬ溴化锭的１×ＴＢＥ缓冲液中染色（３０～４５）ｍｉｎ，在紫外灯下观察。２犛犖／犜２４９７．１５—２０１０６．５．２ 银染将凝胶用蒸馏水洗两次，浸入１０％乙醇和０．５％冰醋酸溶液固定１０ｍｉｎ；用蒸馏水洗两次，１％ＨＮＯ３作用１０ｍｉｎ，再浸入０．０１２％ＡｇＮＯ３（１／１０００甲醛）溶液中３０ｍｉｎ；用蒸馏水洗（３～５）次，然后浸入０．２８ｍｏｌ／Ｌ预冷碳酸钠（含１／２０００甲醛）溶液中显色，最后，用１０％ＮａＣＯ３终止显色。７ 试验结果观察并记录聚丙烯酰胺凝胶上的ＤＮＡ单链带，根据异常泳动变位筛查突变样本。犛犖／犜２４９７．１５—２０１０书书书０１０２—５１．７９４２犜／犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准进出口危险化学品安全试验方法第１５部分：犘犆犚犛犛犆犘实验ＳＮ／Ｔ２４９７．１５—２０１０中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６ ６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６ 印张０．５ 字数７千字２０１０年６月第一版 ２０１０年６月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２０９４８ 定价１４．００元