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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２４９７．２３—２０１０进出口危险化学品安全试验方法第２３部分：细胞器的分离实验方法犜犲狊狋犿犲狋犺狅犱狅犳犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋犱犪狀犵犲狉狅狌狊犮犺犲犿犻犮犪犾狊—犘犪狉狋２３：犛犲狆犪狉犪狋犻狅狀狅犳犮犲犾犾狌犾犪狉狅狉犵犪狀犲犾犾犲狊２０１００３０２发布２０１００９１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 ＳＮ／Ｔ２４９７《进出口危险化学品安全试验方法》系列标准共分为２９部分：———第１部分：体内哺乳动物肝细胞程序外ＤＮＡ合成（ＵＤＳ）试验；———第２部分：空斑形成细胞（ＰＦＣ）试验；———第３部分：大型蟤繁殖试验；———第４部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验；———第５部分：睾丸细胞ＵＤＳ试验；———第６部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验；———第７部分：小鼠耳肿胀试验；———第８部分：窝淋巴结试验；———第９部分：血清溶血素测定试验；———第１０部分：Ｔ淋巴细胞增殖功能测定试验；———第１１部分：种系突变试验；———第１２部分：单细胞凝胶电泳分析试验；———第１３部分：荧光原位杂交试验；———第１４部分：ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳试验；———第１５部分：ＰＣＲＳＳＣＰ实验；———第１６部分：ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ实验；———第１７部分：哺乳动物行为毒理学试验；———第１８部分：ＤＮＡ加合物的检测方法；———第１９部分：ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ实验；———第２０部分：Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定蛋白质含量；———第２１部分：琼脂糖凝胶电泳试验；———第２２部分：ＤＮＡ的Ｔｍ值测定方法；———第２３部分：细胞器的分离实验方法；———第２４部分：细胞免疫功能体外检测方法；———第２５部分：体液免疫功能试验；———第２６部分：巨噬细胞功能试验；———第２７部分：流式细胞术检测凋亡；———第２８部分：穿梭质粒在突变检验中的应用；———第２９部分：生化需氧量（ＢＯＤ）测定。本部分为ＳＮ／Ｔ２４９７系列标准的第２３部分。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分负责起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国湖南出入境检验检疫局。本部分主要起草人：吕刚、王利兵、冯智稢、李学洋、赵青、庞震。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２４９７．２３—２０１０进出口危险化学品安全试验方法第２３部分：细胞器的分离实验方法１ 范围ＳＮ／Ｔ２４９７的本部分规定了进出口危险化学品安全试验细胞器的分离实验方法中，试验样品、试验溶液和试验步骤。本部分适用于进出口危险化学品安全试验细胞器的分离实验方法。２ 术语和定义下列术语和定义适用于本部分。２．１线粒体 犿犻狋狅犮犺狅狀犱狉犻狅狀真核细胞内的双层膜细胞器，是细胞内氧化磷酸化和形成ＡＴＰ的主要场所。２．２微粒体 犿犻犮狉狅狊狅犿犲狊细胞被匀浆破碎时，内膜系统的膜结构破裂后自己重新封闭起来的小囊泡（主要是内质网和高尔基体），这些小囊泡的直径大约１００ｎｍ左右，是异质性的集合体。２．３内质网体 犲狀犱狅狆犾犪狊犿犻犮狉犲狋犻犮狌犾狌犿在细胞中由膜围成的隧道系统，是细胞中的重要细胞器。３ 原理细胞内不同结构的比重和大小都不相同，离心的沉降速度也不相同，根据这一原理，用差速离心法，先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。４ 试剂４．１ 生理盐水４．２ 犚犛犅溶液Ｔｒｉｓ·Ｃｌ的终浓度为１０ｍＭ；ＭｇＣｌ２的终浓度为３ｍＭ；ＫＣｌ的终浓度为１０ｍＭ。用稀盐酸调ｐＨ值至７．４，高压灭菌后，４℃保存。４．３ ２×犅狌犳犳犲狉犈溶液中各组分含量为：Ｄ山梨醇的终浓度为２Ｍ；ＨＥＰＥＳ的终浓度为１０ｍＭ；ＥＤＴＡ的终浓度为２ｍＭ。用稀ＮａＯＨ溶液调ｐＨ值至７．４，膜过滤除菌，４℃保存。５ 试验步骤５．１ 细胞裂解将细胞用ＲＳＢ溶液重悬，按１∶１０的体积比加入３％的ＮＰ４０，反复混匀，冰浴１０ｍｉｎ。５．２ 细胞核与线粒体的分离在超速离心机上，将细胞裂解物以５０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，收集上清液；１犛犖／犜２４９７．２３—２０１０在沉淀中加入等体积的２×ＢｕｆｆｅｒＥ，重悬后再次以５０００ｒ／ｍｉｎ低速离心２０ｍｉｎ，收集上清液；合并两次的上清液，并以１３０００ｒ／ｍｉｎ（１２０００×犵）离心１ｈ，沉淀即为细胞核（Ｎｕｃｌｅａｒ）与线粒体（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ），将其重悬于ＲＳＢ中，分装后－８０℃冻存。５．３ 微粒体和内质网体的分离将１３０００ｒ／ｍｉｎ离心所得的上清液再次以２３０００ｒ／ｍｉｎ（４００００×犵）离心１ｈ，所得上清液为细胞浆液，分装后－８０℃冻存；收集沉淀，此时沉淀为微粒体与内质网体，小心的用５ｍＬ１×ＢｕｆｆｅｒＥ洗涤沉淀，并以２３０００ｒ／ｍｉｎ（４００００×犵）离心３０ｍｉｎ；将离心所得沉淀重悬于２ｍＬ１×ＢｕｆｆｅｒＥ，用注射器针头反复抽吸沉淀，使其尽可能被破碎；将破碎后的沉淀重悬液以３７０００ｒ／ｍｉｎ（１０００００×犵）高速离心２ｈ，上清液即为内质网体腔液，分装后－８０℃冻存；沉淀为内质网体腔膜，重悬于ＲＳＢ中，分装后－８０℃冻存。２犛犖／犜２４９７．２３—２０１０书书书０１０２—３２．７９４２犜／犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准进出口危险化学品安全试验方法第２３部分：细胞器的分离实验方法ＳＮ／Ｔ２４９７．２３—２０１０中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６ ６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６ 印张０．５ 字数５千字２０１０年６月第一版 ２０１０年６月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２０９５６ 定价１４．００元