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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２４９７．４—２０１０进出口危险化学品安全试验方法第４部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验犜犲狊狋犿犲狋犺狅犱狅犳犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋犱犪狀犵犲狉狅狌狊犮犺犲犿犻犮犪犾狊—犘犪狉狋４：犛犪犮犮犺犪狉狅犿狔犮犲狊犮犲狉犲狏犻狊犻犪犲犿犻狋狅狋犻犮狉犲犮狅犿犫犻狀犪狋犻狅狀犪狊狊犪狔２０１００３０２发布２０１００９１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 ＳＮ／Ｔ２４９７《进出口危险化学品安全试验方法》系列标准共分为２９部分：———第１部分：体内哺乳动物肝细胞程序外ＤＮＡ合成（ＵＤＳ）试验；———第２部分：空斑形成细胞（ＰＦＣ）试验；———第３部分：大型溞繁殖试验；———第４部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验；———第５部分：睾丸细胞ＵＤＳ试验；———第６部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验；———第７部分：小鼠耳肿胀试验；———第８部分：腘窝淋巴结试验；———第９部分：血清溶血素测定试验；———第１０部分：Ｔ淋巴细胞增殖功能测定试验；———第１１部分：种系突变试验；———第１２部分：单细胞凝胶电泳分析试验；———第１３部分：荧光原位杂交试验；———第１４部分：ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳试验；———第１５部分：ＰＣＲＳＳＣＰ实验；———第１６部分：ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ实验；———第１７部分：哺乳动物行为毒理学试验；———第１８部分：ＤＮＡ加合物的检测方法；———第１９部分：ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ实验；———第２０部分：Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定蛋白质含量；———第２１部分：琼脂糖凝胶电泳试验；———第２２部分：ＤＮＡ的Ｔｍ值测定方法；———第２３部分：细胞器的分离实验方法；———第２４部分：细胞免疫功能体外检测方法；———第２５部分：体液免疫功能试验；———第２６部分：巨噬细胞功能试验；———第２７部分：流式细胞术检测凋亡；———第２８部分：穿梭质粒在突变检验中的应用；———第２９部分：生化需氧量（ＢＯＤ）测定。本部分为ＳＮ／Ｔ２４９７的第４部分。本部分修改采用经济合作与发展组织（ＯＥＣＤ）化学品测试指南ＮＯ．４８１《酿酒酵母有丝分裂重组试验》，其有关技术内容与上述方法完全一致，在标准文本格式上按ＧＢ／Ｔ１．１—２０００做了编辑性修改。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分负责起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国湖南出入境检验检疫局。本部分主要起草人：熊中强、王利兵、彭梓、张园、赵琢、韩伟。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２４９７．４—２０１０进出口危险化学品安全试验方法第４部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验１ 范围ＳＮ／Ｔ２４９７的本部分规定了进出口危险化学品进行酿酒酵母有丝分裂重组试验的试验原理、试验程序和试验结果。本部分适用于判定进出口危险化学品能否引起真核微生物酵母的有丝分裂重组。２ 术语和定义下列术语和定义适用于本部分。２．１ 有丝分裂交换 犿犻狋狅狋犻犮犮狉狅狊狊犻狀犵狅狏犲狉基因之间ＤＮＡ片段的交换（通常在一个基因和其着丝粒之间），导致交互的产物。２．２ 有丝分裂基因转换 犿犻狋狅狋犻犮犵犲狀犲犮狅狀狏犲狉狊犻狅狀在一个基因内序列的信息单向转移，主要导致非交互产物。３ 原理３．１ 利用酿酒酵母（犛犪犮犮犺犪狉狅犿狔犮犲狊犮犲狉犲狏犻狊犻犪犲）的某些菌株从杂合等位基因变为纯合等位基因时，菌株的一些表现性状及生长特性的改变来检测受试物是否引起了真核微生物酵母的有丝分裂重组。有丝分裂重组可以在酵母基因之间及同一基因内发生，前者称为交换，后者称为转换。３．２ 试验中有丝分裂的交换是通过杂合菌株中产生隐性纯合子的菌落或子菌落证实的；而有丝分裂转换是通过在同样的基因上携有两个不同的缺陷型等位基因的营养缺陷型杂合子菌株中产生原养型恢复体证实的。３．３ 利用二倍体酿酒酵母菌株Ｄ４在选择性培养基中生长的特性检测有丝分裂基因转换。ａｄｅ２２，ａｄｅ２１；ｔｒｐ５１２和ｔｒｐ５２７是ａｄｅ２和ｔｒｐ５位点上的异点等位基因。这些等位基因进行有丝分裂基因转换，产生携带一个野生型等位基因的原生型菌落，这些菌落能在缺乏色氨酸（ｔｒｐ）或腺嘌呤的选择性培养基上生长。３．４ 酵母菌株的有丝分裂交换可通过观察Ｄ５或Ｄ７菌株菌落的颜色变化（产生红色或粉色的纯合子有丝分裂交换）或观察Ｄ７菌株产生放线菌酮抗性（ｃｙｈｒ２）在含放线菌酮的培养基上生长来检测。４ 试验程序４．１ 试验方法４．１．１ 最常用的菌株为二倍体Ｄ５、Ｄ７、Ｄ４和ＪＤ１菌株，所用的传代的培养菌株的自发有丝分裂重组频率应在可接受的正常范围内。４．１．２ 在试验的不同阶段选用适当的培养基（ＹＥＰＤ，ＳＭＭ，ＳＣＭ及选择性培养基）培养试验菌株，以测定其存活率及有丝分裂重组频率。４．１．３ 细胞应在有和无外源性哺乳动物代谢活化系统的情况下染毒，最常用的代谢活化系统是啮齿类动物肝脏制备的Ｓ９混合物。１犛犖／犜２４９７．４—２０１０４．２ 受试物准备４．２．１ 受试物、阳性对照物应溶解于水或适当的赋形剂中。４．２．２ 受试物溶液临用前新鲜配制，溶剂的终浓度应对细胞的活力和生长特性不产生显著影响。４．３ 剂量与分组４．３．１ 至少应设５个不同的受试物有效剂量组。４．３．２ 剂量范围根据细胞毒性及受试物的溶解度来确定，最低剂量应对细胞发育能力无影响。易溶解的无毒受试物的接触水平应根据受试物的具体情况来定；有毒化学物的最高试验浓度应不使细胞存活率低于５％～１０％。４．３．３ 每次试验应设阴性对照，包括空白和溶剂对照；阳性对照一般用甲基磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、４硝基喹啉Ｎ氧化物或环磷酰胺作阳性对照物。对照除不加受试物外，其他条件与试验组完全相同。４．３．４ 对于有丝分裂基因转换产生原养型试验和存活率试验，每个浓度水平应至少用３个重复平板；对于有丝分裂交换产生隐性纯合子试验，应增加重复的平板数以得到足够的菌落数。４．４ 试验步骤４．４．１ 通常用液体试验法处理静止期或生长期酿酒酵母细胞，首次实验应该用生长期细胞进行。将细胞（１～５）×１０７个／ｍＬ于２８℃～３０℃接触受试物１８ｈ。在有代谢活化的试验中应加入足量的哺乳动物代谢活化系统。４．４．２ 细胞经离心、洗涤并接种于适当的培养基。于２８℃～３０℃避光培养４ｄ～７ｄ后，对平板存活率和有丝分裂重组诱导进行计算。４．４．３ 用于检测有丝分裂交换，产生红色和粉红色纯合子菌落的平板应在计数前于４℃再存放１ｄ～２ｄ，以产生适当的含色素菌落。４．４．４ 利用酵母进行试验的结果都应进行独立的重复试验，以增加结果在统计学方面的有效性。５ 试验结果５．１ 结果处理５．１．１ 以表格形式记录重组率检测和存活率检测中试验组和对照组每个平板的菌落数、重组体数。５．１．２ 计算各组的菌落、重组体均数、标准差及重组率和存活率。５．１．３ 用适当的统计学方法对试验组和对照组的重组率均值的差别进行显著性检验，并在可能时计算受试物浓度与重组率的剂量相关关系。５．２ 结果评价５．２．１ 重组体率随受试物剂量增加而增高并具有统计学意义，或至少在一个剂量水平中出现可重复的并有统计学意义的重组体率增高，即可判为阳性结果。５．２．２ 未出现上述两种情况，则认为该受试物在本试验系统中的结果为阴性。５．３ 试验报告试验报告应包括以下内容：———受试物、溶剂的理化特性，受试物配制方法；———菌株种类、基因型、来源，菌株鉴定方法及结果，生长条件及培养基制备方法；———阳性对照物的选择及制备，溶剂对照的设置；———处理条件和情况的描述，包括染毒浓度的选择、染毒持续时间、终止处理的方法；———每个平板的重组体菌落、存活菌落计数，各组重组体率平均值及标准差；———显著性检验及相关计算结果；———结果的评价。２犛犖／犜２４９７．４—２０１０书书书０１０２—４．７９４２犜／犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准进出口危险化学品安全试验方法第４部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验ＳＮ／Ｔ２４９７．４—２０１０中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６ ６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６ 印张０．５ 字数６千字２０１０年５月第一版 ２０１０年５月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２０９２４ 定价１４．００元