搜索
书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２４９７．２—２０１０进出口危险化学品安全试验方法第２部分：空斑形成细胞（犘犉犆）试验犜犲狊狋犿犲狋犺狅犱狅犳犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋犱犪狀犵犲狉狅狌狊犮犺犲犿犻犮犪犾狊—犘犪狉狋２：犘犾犪狇狌犲犳狅狉犿犻狀犵犮犲犾犾犪狊狊犪狔２０１００３０２发布２０１００９１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 ＳＮ／Ｔ２４９７《进出口危险化学品安全试验方法》系列标准共分为２９部分：———第１部分：体内哺乳动物肝细胞程序外ＤＮＡ合成（ＵＤＳ）试验；———第２部分：空斑形成细胞（ＰＦＣ）试验；———第３部分：大型溞繁殖试验；———第４部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验；———第５部分：睾丸细胞ＵＤＳ试验；———第６部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验；———第７部分：小鼠耳肿胀试验；———第８部分：腘窝淋巴结试验；———第９部分：血清溶血素测定试验；———第１０部分：Ｔ淋巴细胞增殖功能测定试验；———第１１部分：种系突变试验；———第１２部分：单细胞凝胶电泳分析试验；———第１３部分：荧光原位杂交试验；———第１４部分：ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳试验；———第１５部分：ＰＣＲＳＳＣＰ实验；———第１６部分：ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ实验；———第１７部分：哺乳动物行为毒理学试验；———第１８部分：ＤＮＡ加合物的检测方法；———第１９部分：ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ实验；———第２０部分：Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定蛋白质含量；———第２１部分：琼脂糖凝胶电泳试验；———第２２部分：ＤＮＡ的Ｔｍ值测定方法；———第２３部分：细胞器的分离实验方法；———第２４部分：细胞免疫功能体外检测方法；———第２５部分：体液免疫功能试验；———第２６部分：巨噬细胞功能试验；———第２７部分：流式细胞术检测凋亡；———第２８部分：穿梭质粒在突变检验中的应用；———第２９部分：生化需氧量（ＢＯＤ）测定。本部分为ＳＮ／Ｔ２４９７的第２部分。本部分修改采用经济合作与发展组织（ＯＥＣＤ）化学品测试指南ＮＯ．４９０《空斑形成细胞试验》，其有关技术内容与上述方法完全一致，在标准文本格式上按ＧＢ／Ｔ１．１—２０００做了编辑性修改。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分负责起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国湖南出入境检验检疫局。本部分主要起草人：李宁涛、王利兵、彭梓、张园、熊中强、张颖。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２４９７．２—２０１０进出口危险化学品安全试验方法第２部分：空斑形成细胞（犘犉犆）试验１ 范围ＳＮ／Ｔ２４９７的本部分规定了进出口危险化学品安全试验方法空斑形成细胞试验的试验原理、试验材料、试验程序和试验结果。本部分适用于检测进出口危险化学品经一次或反复多次接触受试物后，对试验动物体液免疫功能的影响。２ 术语和定义下列术语和定义适用于本部分。２．１ 空斑形成细胞试验 狆犾犪狇狌犲犳狅狉犿犻狀犵犮犲犾犾犪狊狊犪狔体外检测和计数产生ＩｇＭ、ＩｇＧ等Ｉｇ抗体形成细胞的一种方法，把含有空斑形成细胞悬液与羊红细胞悬液混合，将其均匀地悬于半固体琼脂培养基或液体培养基中，在补体的参与下，在红色背景上可见到透明区，即是抗羊红细胞ＩｇＭ空斑形成细胞。２．２ 体液免疫 犺狌犿狅狉犪犾犻犿犿狌狀犻狋狔Ｂ淋巴细胞在抗原的刺激下，增殖分化成浆细胞，浆细胞产生并分泌抗原特异性抗体的过程。３ 试验原理空斑形成细胞试验（简称ＰＦＣ试验），是检测和计数产生ＩｇＭ、ＩｇＧ等Ｉｇ空斑形成细胞的一种方法，由于试验具有特异性高、筛检力强、不需要特殊的仪器设备等优点，故可作为判断外源化学物对机体体液免疫功能影响的指标。将经羊红细胞（ＳＲＢＣ）免疫４ｄ～５ｄ的小鼠脾脏制成单个细胞悬液，在半固体琼脂凝胶介质中与ＳＲＢＣ混合，在平皿或玻片上铺成薄层，置３７℃温育，在有补体参与下，使分泌抗体的淋巴细胞致敏周围的ＳＲＢＣ产生溶血反应，在其周围形成一个肉眼可见的透明溶血区，称为溶血斑。该方法检出的细胞主要是ＩｇＭ空斑形成细胞。为检测分泌抗羊红细胞的ＩｇＧ抗体形成细胞，需要加入抗ＩｇＧ的抗体，以使羊红细胞在加入补体后溶解。４ 材料及试剂———Ｈａｎｋｓ液、ＳＡ缓冲液；———新鲜羊红细胞；———豚鼠血清；———琼脂糖（凝固点４２℃）；———清洁玻片；———试管；———平皿；———不锈钢筛网；１犛犖／犜２４９７．２—２０１０———微量取样器；———恒温水浴箱；———温箱；———有凹槽的玻片架。５ 试验程序５．１ 试验动物５．１．１ 选择健康成年小鼠，常用昆明、ＬＡＣＡ、ＢＡＬＢ／Ｃ等品系，雌性与雄性动物均可，鼠龄在６周龄～８周龄。５．１．２ 动物室温度应维持在２２℃±３℃，相对湿度为３０％～７０％，选用常规饲料，自由进食及饮水。５．２ 剂量与分组５．２．１ 染毒剂量：染毒组一般设３个剂量组，高剂量组为１／５ＬＤ５０～１／１０ＬＤ５０，低剂量组以不引起任何免疫毒性，在低、高剂量间设中剂量组。通常组间距为２倍～５倍。５．２．２ 按随机方法将动物分为对照组及染毒组，各组动物１０只。５．３ 染毒染毒途径及染毒次数依试验目的、人群接触受试物的常见途径及受试物的理化性质而定。５．４ 抗原免疫５．４．１ 抗原免疫时间可在染毒前、染毒同时及染毒后注射抗原，视受试物对活化细胞还是静止细胞的影响而定。以羊红细胞为抗原，抗原量通常以（１～５）×１０８个为宜。５．４．２ 免疫途径，首选经静脉注射抗原。但染毒途径为腹腔注射时，抗原注入应选择其他途径。５．５ 试验准备５．５．１ 抗原常以ＳＲＢＣ做抗原，用消毒针头刺入羊颈静脉取血，将采集羊血放入有玻璃珠的三角瓶中，充分振摇，以脱纤维，放入冰箱４℃保存备用，可保存２周。５．５．２ 免疫动物取保存的羊血，用生理盐水洗３次，每次离心（２０００ｒ／ｍｉｎ）１０ｍｉｎ，计数细胞并调整细胞浓度，每只鼠静脉注射（１～５）×１０８个羊红细胞。５．５．３ 制备补体从豚鼠股动脉放血或心脏采血，分离血清，使用前用ＳＲＢＣ吸收。将压积ＳＲＢＣ１ｍＬ加入５ｍＬ豚鼠血清中，置于４℃３０ｍｉｎ，中间振摇数次，离心取上清液，分装小瓶，置－７０℃冰箱保存。５．５．４ 玻片涂膜在玻片上用刷子刷上一薄层０．５％琼脂糖，待干后放片盒可长期保存备用。５．６ 试验步骤５．６．１ 免疫小鼠脾细胞悬液的制备将用ＳＲＢＣ免疫过的小鼠在免疫后４ｄ～６ｄ用颈椎脱臼法处死，取出脾脏，放在盛有Ｈａｎｋｓ液的小平皿内。用镊子轻轻撕碎脾脏，制成单个细胞悬液，经２层～４层纱布过滤，以除去大的组织块和结缔组织，离心（１０００ｒ／ｍｉｎ）１０ｍｉｎ，用Ｈａｎｋｓ液洗两遍细胞，最后将细胞悬浮在５ｍＬＨａｎｋｓ液中，即为免疫脾细胞悬液。５．６．２ 试验玻片制备将表层培养基（１％琼脂糖）加热溶解，放４５℃水溶保温，与等量ｐＨ７．２～７．４的２倍浓度Ｈａｎｋｓ液混合。然后在水浴中分装到小试管，每管０．５ｍＬ，再向管内加入１０％ＳＲＢＣ（用ＳＡ液配制）５０μＬ，随后加入适量的脾细胞悬液２０μＬ～１００μＬ，充分混匀，迅速倾倒在事先用琼脂糖涂膜的玻片上，待琼脂凝固后，将玻片倒放在片架上，将装有玻片的架子小心放入特制的盒内，在３７℃温箱中温育１ｈ～１．５ｈ。２犛犖／犜２４９７．２—２０１０５．６．３ 加补体取出温育过的玻片，加入用ＳＡ液稀释的补体（１∶１０），再在３７℃温箱内温育１ｈ～１．５ｈ，即可出现肉眼可见的溶血空斑，计数空斑。６ 试验结果６．１ 结果处理以表格形式列出每只动物编号、性别、体重，动物处死时脾脏重、胸腺重及每张玻片上的空斑形成细胞数，计算ＰＦＣ数／１０６脾细胞，对染毒组与对照组动物的ＰＦＣ数／１０６脾细胞进行统计比较。６．２ 结果评价根据染毒组与对照组ＰＦＣ数，评价染毒组动物ＰＦＣ数／１０６脾细胞是否减少，以评定受试物对体液免疫功能是否有影响及影响的程度。６．３ 试验报告试验报告应包括以下内容：———动物品、系、来源、饲养条件、动物室环境；———受试物的理化性质及配制方法、染毒时间、染毒途径；———羊红细胞来源，取血时间及保存时间和条件；———羊红细胞的处理及配制方法，动物免疫条件包括途径和剂量；———动物处死的时间及方法；———动物开始时体重、结束时体重、脾脏重、胸腺重；———计数玻片上空斑，计算ＰＦＣ数／１０６脾细胞；———统计学分析方法；———结果评价。６．４ 结果解释外源化学物对动物体液免疫功能的影响，多数能引起人体体液免疫功能的变化，但需要用ＭｉｓｈｅｌｌＤｕｔｔｏｎ检测方法进行证实。犛犖／犜２４９７．２—２０１０书书书０１０２—２．７９４２犜／犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准进出口危险化学品安全试验方法第２部分：空斑形成细胞（犘犉犆）试验ＳＮ／Ｔ２４９７．２—２０１０中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６ ６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６ 印张０．５ 字数８千字２０１０年５月第一版 ２０１０年５月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２０９２３ 定价１４．００元