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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２４８２—２０１０马铃薯丛枝植原体检疫鉴定方法犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳狆狅狋犪狋狅狑犻狋犮犺犲狊’犫狉狅狅犿狆犺狔狋狅狆犾犪狊犿犪２０１００１１０发布２０１００７１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布食品伙伴网书书书前 言本标准的附录Ａ和附录Ｂ均为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准由中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院负责起草。本标准主要起草人：王秀芬、赵文军、刘伟、彭金火、牟海青、周铭、朱水芳。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２４８２—２０１０食品伙伴网马铃薯丛枝植原体检疫鉴定方法１ 范围本标准规定了马铃薯丛枝植原体的检疫鉴定方法。本标准适用于所有进境种薯、商品薯、组培苗和脱毒苗等马铃薯种质中马铃薯丛枝植原体的检疫鉴定。２ 原理２．１ 学名和分类地位学名：Ｐｏｔａｔｏｗｉｔｃｈｅｓ’ｂｒｏｏｍｐｈｙｔｏｐｌａｓｍａ缩写：ＰＷＢ分类地位：细菌界（Ｂａｃｔｅｒｉａ），硬壁菌门（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ），柔膜菌纲（Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ），非固醇菌原体目（Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ），非固醇菌原体科（Ａｅｈｏｌｅｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ），植原体属（犘犺狔狋狅狆犾犪狊犿犪），三叶草丛蔟组（Ｃｌｏｖｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｇｒｏｕｐ，１６ＳｒⅥ）。其他资料参见附录Ａ。２．２ 鉴定原理马铃薯丛枝植原体的分子生物学特性为本标准鉴定方法的主要依据。３ 仪器和用具３．１ 仪器设备：ＰＣＲ仪、超净工作台、电泳仪、凝胶成像分析仪、冷冻离心机、电子天平（１／１００００ｇ）、ｐＨ计、水浴锅、振荡器等。３．２ 用具；可调移液器（０μＬ～２０μＬ、２０μＬ～２００μＬ、２００μＬ～１０００μＬ）及相关吸头、研钵、离心管（１．５ｍＬ、１０ｍＬ）、ＰＣＲ管（０．２ｍＬ）、量筒、烧杯、镊子等。４ 试剂４．１ 研磨液磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４）０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸二氢钠（ＮａＨ２ＰＯ４）０．０３ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ１０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ８．０）蔗糖１０％（质量浓度）ＰＶＰ４０２％（质量浓度）调整ｐＨ至７．６，然后过滤除菌。使用前加入０．１５％（质量浓度）牛血清白蛋白（ＢＳＡ）和１ｍｍｏｌ／Ｌ抗坏血酸维生素Ｃ。４．２ 犆犜犃犅缓冲液ＣＴＡＢ２％（质量浓度）ＴｒｉｓＨＣｌ１００ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ８．０）ＥＤＴＡ２０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ８．０）氯化钠（ＮａＣｌ）１．４ｍｏｌ／ＬＰＶＰ４０１％（质量浓度）１犛犖／犜２４８２—２０１０食品伙伴网４．３ 其他试剂苯酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙醇、琼脂糖、溴化乙锭、犜犪狇ＤＮＡ聚合酶、１０×ＰＣＲ缓冲液、ｄＮＴＰ液（２．５ｍｍｏｌ／ＬｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ）。５ 检疫鉴定５．１ 犇犖犃提取大约０．３ｇ组织（叶柄、叶脉、茎）在３ｍＬ预冷研磨液中研磨，将粗汁液转移至２ｍＬ微量离心管中。４℃下４５００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ。将悬浮液转至新的２ｍＬ离心管中。４℃下１３０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ。去掉上清液。在７５０μＬ预热（５５℃）ＣＴＡＢ缓冲液中悬浮沉淀［少量ＣＴＡＢ缓冲液（如１００μＬ）更易悬浮沉淀，然后加入剩余的ＣＴＡＢ缓冲液（如６５０μＬ）］。５５℃下孵育３０ｍｉｎ，间歇颠倒混匀。离心管在冰上冷却３０ｓ。加入７５０μＬ三氯甲烷∶异戊醇（２４∶１体积比），涡旋振荡。４℃或室温下１３０００ｒ／ｍｉｎ离心４ｍｉｎ。小心将上面水相转至一个新的１．５ｍＬ离心管中。加入１体积预冷异丙醇，涡旋振荡。冰上孵育４ｍｉｎ后４℃或室温下１３０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ。去掉上清液。用５００μＬ７０％（体积分数）冷乙醇洗涤ＤＮＡ沉淀，４℃或室温下１３０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ。空气干燥ＤＮＡ沉淀。用２０μＬ灭菌蒸馏水悬浮沉淀。５５℃下孵育离心管１０ｍｉｎ有助于ＤＮＡ再悬浮。－２０℃短期贮存或－８０℃长期贮存。 注：也可采用商品试剂盒提取。５．２ 引物序列引物采用植原体１６ＳｒＤＮＡ（参见附录Ｂ）通用引物Ｐ１／Ｐ７和Ｒ１６Ｆ２ｎ／Ｒ１６Ｒ２。引物序列见表１。表１ 犘犆犚检测的引物引物名称引物序列５’３’产物／ｂｐ通用引物Ｐ１Ｐ７ＡＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧＧＡＴＴＣＧＴＣＣＴＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＴＴ１８００Ｒ１６Ｆ２ｎＲ１６Ｒ２ＡＣＧＡＣＴＧＣＴＡＡＧＡＣＴＧＧＴＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣＡＡＡＣＣＣＣＧ１２５１５．３ 巢式犘犆犚用引物Ｐ１／Ｐ７进行第１轮ＰＣＲ。反应体系见表２。反应条件为：９４℃／５ｍｉｎ；９４℃／３０ｓ，５３℃／３０ｓ，７２℃／１ｍｉｎ，３５个循环；７２℃／１０ｍｉｎ。表２ 犘犆犚反应体系试剂名称加样量／μＬ１０×ＰＣＲ缓冲液２．０５０ｍｍｏｌ／Ｌ氯化镁０．６１０ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ０．４５μｍｏｌ／Ｌ上游引物１．０５μｍｏｌ／Ｌ下游引物１．０５Ｕ／μＬ犜犪狇ＤＮＡ聚合酶０．１１０ｎｇ／μＬ模板ＤＮＡ２．０双蒸水补足反应总体积为２０μＬ 第１轮ＰＣＲ产物用灭菌双蒸水１∶５０（体积比）稀释，取１μＬ为模板利用通用引物Ｒ１６Ｆ２ｎ／Ｒ１６Ｒ２进行第２轮ＰＣＲ反应，反应体系见表２。Ｒ１６Ｆ２ｎ／Ｒ１６Ｒ２反应条件为：９４℃／５ｍｉｎ；９４℃／３０ｓ，２犛犖／犜２４８２—２０１０食品伙伴网６０℃／３０ｓ，７２℃／１ｍｉｎ，３５个循环；７２℃／１０ｍｉｎ。 上述反应中均需同时作阳性对照（植原体１６ＳｒＤＮＡ质粒）、阴性对照（健康马铃薯叶片）和空白对照（以蒸馏水替代模板ＤＮＡ）。用１×ＴＡＥ电泳缓冲液制备１％的琼脂糖凝胶（含０．５μｇ／ｍＬ溴化乙锭），用１μＬ６×加样缓冲液与５μＬ第２轮ＰＣＲ扩增产物混合，然后将其和适合的ＤＮＡ分子量标准物分别加入到样品孔中。电泳结束后将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统观察并保留结果。５．４ 犘犆犚产物序列犚犉犔犘图谱分析将第二轮ＰＣＲ产物进行序列测定。所测序列通过ＤＮＡＦＰＣｌｕｓｔｅｒ１．０软件进行ＲＦＬＰ图谱分析，ＤＮＡ分子量标准选用Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ２５ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒ，琼脂糖凝胶浓度为３％，最小片段选为１０ｂｐ。６ 结果评定在阳性对照有目标条带，而阴性对照及空白对照没有条带时，第二轮ＰＣＲ产物在１２５１ｂｐ处有条带出现，且序列ＲＦＬＰ图谱分析结果与马铃薯丛枝植原体标准图谱一致，即判断样品带有马铃薯丛枝植原体；第二轮ＰＣＲ产物在１２５１ｂｐ处没有条带，判定样品不带有马铃薯丛枝植原体。７ 样品保存对于检测结果显示为阳性的样品，应对样品进行保存。病样在－２０℃或者－８０℃冰箱中保存，做好标记和登记工作。８ 结果记录与资料保存完整的实验记录包括：样品的来源、种类、接收时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。ＰＣＲ检测需有电泳结果照片及测序结果。３犛犖／犜２４８２—２０１０食品伙伴网附 录 犃（资料性附录）马铃薯丛枝植原体背景资料犃．１ 分布亚洲：中国（台湾）、印度、日本、乌兹别克斯坦。欧洲：保加利亚、前苏联（欧洲部分）、意大利、波兰、俄罗斯联邦（欧洲部分）、乌克兰。大洋洲：澳大利亚、汤加。北美洲：加拿大、美国。犃．２ 寄主范围荷包牡丹（犇犻犮犲狀狋狉犪狊狆犲犮狋犪犫犻犾犻狊）、紫苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）、马铃薯（犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿）、杂种车轴草（犜狉犻犳狅犾犻狌犿犺狔犫狉犻犱狌犿）、红车轴草（犜狉犻犳狅犾犻狌犿狆狉犪狋犲狀狊犲）、白车轴草（犜狉犻犳狅犾犻狌犿狉犲狆犲狀狊）、烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）、长春花（犆犪狋犺犪狉犪狀狋犺狌狊狉狅狊犲狌狊）、柳属（犛犪犾犻狓）。犃．３ 症状感病马铃薯植株徒长，顶部叶片变紫色并卷曲，花变绿色、僵化，露出土表的马铃薯部分长出很多枝芽，并长出许多匍匐枝，土表下的马铃薯块茎长出许多根，上部植株胶质化，茎干细小，生产的马铃薯个体小，产量低。病害后期植株维管束死亡，植株枯死。犃．４ 传播途径马铃薯种薯及组培苗是该病原菌远距离传播主要途径，叶蝉（犛犮犾犲狉狅狉犪犮狌狊犳犾犪狏狅狆犻犮狋狌狊、犛犮犾犲狉狅狉犪犮狌狊犱犪狊犻犱狌狊、犛犮犾犲狉狅狉犪犮狌狊犫犪犾犾犻）是传播介体。犃．５ 分子生物学特性植原体基因组包括染色体与染色体外（质粒）两部分，遗传物质为ｄｓＤＮＡ，相对分子质量约为５×１０８道尔顿。此外，植原体基因组ＤＮＡ中，Ｇ＋Ｃ含量较低，为２３％～２９．５％，Ａ＋Ｔ含量较丰富。１６ＳｒＤＮＡ基因是原核生物的高度保守序列，在植原体及其他支原体原核生物的分类研究中，它常作为系统分类比较的主要特征。犃．６ 病菌形态特征马铃薯病株茎、叶筛管和靠近筛管的薄壁细胞细胞质内，有大小不一，形态多数为球形或椭圆形的植原体存在。植原体初生体的直径多为６０ｎｍ～１００ｎｍ，呈电子密集及微颗粒状。植原体屋细胞壁，但在其外表包有单位膜。单位膜由２层蛋白质膜和中间一层脂肪膜组成，厚度约为１０ｎｍ。在显微镜下，植原体的内含物清晰可见，胞内含有核糖体，脱氧核糖核酸线状体和核糖核酸线状体。４犛犖／犜２４８２—２０１０食品伙伴网附 录 犅（资料性附录）马铃薯丛枝植原体核糖体１６犛狉犇犖犃序列犅．１ 马铃薯丛枝植原体核糖体１６犛狉犇犖犃序列（引物犚１６犉２狀／犚１６犚２扩增产物）ＧＡＡＡＣＧＧＴＴＧＣＴＡＡＧＡＣＴＧＧＡＴＡＧＧＡＡＡＣＡＡＡＡＡＧＧＣＡＴＣＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＡＡＡＡＧＡＣＣＴＴＣＴＴＡＣＧＡＡＧＧＴＡＴＧＣＴＴＡＡＡＧＡＧＧＧＧＣＴＴＧＣＧＣＣＡＣＡＴＴＡＧＴＴＡＧＴＴＧＧＴＡＧＡＧＴＡＡＡＡＧＣＣＴＡＣＣＡＡＧＡＣＧＡＴＧＡＴＧＴＧＴＡＧＣＴＧＧＡＣＴＧＡＧＡＧＧＴＴＧＡＡＣＡＧＣＣＡＣＡＴＴＧＧＧＡＣＴＧＡＧＡＣＡＣＧＧＣＣＣＡＡＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴＡＧＧＧＡＡＴＴＴＴＣＧＧＣＡＡＴＧＧＡＧＧＡＡＡＣＴＣＴＧＡＣＣＧＡＧＣＡＡＣＧＣＣＧＣＧＴＧＡＡＣＧＡＴＧＡＡＧＴＡＴＴＴＣＧＧＴＡＴＧＴＡＡＡＧＴＴＣＴＴＴＴＡＴＴＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧＴＡＧＴＧＧＡＡＡＡＡＣＴＡＴＡＴＴＧＡＣＧＴＴＡＴＴＣＡＡＴＧＡＡＴＡＡＧＣＣＣＣＧＧＣＴＡＡＣＴＡＴＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＧＡＣＡＴＡＧＧＧＧＧＣＧＡＧＣＧＴＴＡＴＣＣＧＧＡＡＴＴＡＴＴＧＧＧＣＧＴＡＡＡＧＧＧＴＧＣＧＴＡＧＧＣＴＧＴＴＡＧＡＴＡＡＧＴＣＴＡＴＡＡＴＴＴＡＡＴＴＴＣＡＧＴＧＣＴＴＡＡＣＧＣＴＧＴＣＴＴＧＴＴＡＴＡＧＡＡＡＣＴＧＴＣＴＴＧＡＣＴＡＧＡＧＴＧＡＧＡＴＡＧＡＧＧＣＡＡＧＣＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＧＴＧＴＡＧＣＧＧＴＡＡＡＡＡＴＧＴＧＴＡＡＡＴＡＴＡＴＧＧＡＧＧＡＡＣＡＣＣＡＧＡＡＧＣＧＴＡＧＧＣＧＧＣＴＴＧＣＴＧＧＧＴＣＴＴＴＡＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＧＣＡＣＧＡＡＡＧＣＧＴＧＧＧＴＡＧＣＡＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＴＡＧＴＣＣＡＣＧＣＣＧＴＡＡＡＣＧＡＴＧＡＧＴＡＣＴＡＡＧＴＧＴＣＧＧＧＧＴＡＡＡＡＣＴＣＧＧＴＡＣＴＧＡＡＧＴＴＡＡＣＡＣＡＴＴＡＡＧＴＡＣＴＣＣＧＣＣＴＧＡＧＴＡＧＴＡＣＧＴＡＣＧＣＡＡＧＴＡＴＧＡＡＡＣＴＴＡＡＡＧＧＡＡＴＴＧＡＣＧＧＧＡＣＴＣＣＧＣＡＣＡＡＧＣＧＧＴＧＧＡＴＣＡＴＧＴＴＧＴＴＴＡＡＴＴＣＧＡＡＧＡＴＡＣＡＣＧＡＡＡＡＡＴＣＴＴＡＣＣＡＧＧＴＣＴＴＧＡＣＡＴＡＣＴＣＴＧＣＡＡＡＧＣＴＡＴＡＧＡＡＡＴＡＴＡＧＴＧＧＡＧＧＴＴＡＴＣＡＧＧＧＡＴＡＣＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＴＧＧＴＴＧＴＣＧＴＣＡＧＴＴＣＧＴＧＴＣＧＴＧＡＧＡＴＧＴＴＡＧＧＴＴＡＡＧＴＣＣＴＡＡＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣＴＴＧＴＣＧＴＴＡＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＣＧＴＡＡＴＧＧＴＧＧＧＧＡＣＴＴＴＡＡＣＧＡＧＡＣＴＧ