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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２４７５—２０１０植物类病毒脱除处理规程犚狌犾犲狊狅犳狆犾犪狀狋狏犻狉狅犻犱狊犲犾犻犿犻狀犪狋犻狅狀２０１００１１０发布２０１００７１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布食品伙伴网书书书中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准植物类病毒脱除处理规程ＳＮ／Ｔ２４７５—２０１０中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６ ６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６ 印张０．５ 字数８千字２０１０年４月第一版 ２０１０年４月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２０７０８ 定价１４．００元食品伙伴网书书书前 言本标准的附录Ａ为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：李桂芬、王仁睿、马洁、李明福、张永江、魏梅生。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２４７５—２０１０食品伙伴网植物类病毒脱除处理规程１ 范围本标准规定了植物类病毒脱除处理方法。本标准适用于检验检疫行业、农业、林业对带有类病毒的植物繁殖材料的脱除处理。２ 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。２．１ 类病毒脱除处理 狏犻狉狅犻犱犲犾犻犿犻狀犪狋犻狅狀通过有效的方法，脱去植物带有的类病毒的过程。２．２ 组织培养 狆犾犪狀狋狋犻狊狊狌犲犮狌犾狋狌狉犲在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体等繁殖材料，培养在人工培养基上，并在人工控制的环境中生长、分化、增殖至再生植株的过程。２．３ 茎尖培养 狊犺狅狅狋犪狆犻犮犲狊犮狌犾狋狌狉犲在无菌条件下剥取植物茎尖（顶端分生组织带１个～２个幼叶原基），在人工控制的条件下分化再生的方法。２．４ 低温处理 犾狅狑狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲狋犺犲狉犪狆狔将植物或植物组织置于低温环境下（２℃～７℃），黑暗或光照条件下持续处理６个月以上来抑制类病毒增殖的方法。２．５ 无类病毒苗 狏犻狉狅犻犱犳狉犲犲狊犲犲犱犾犻狀犵狊经过类病毒脱除处理过程和检测结果为阴性的再生种苗。３ 原理３．１ 处理原则针对检验检疫或生产中发现植物携带管制的类病毒，一般可进行销毁处理。如因植物珍贵或应客户需求，需针对管制的类病毒实施脱除处理。３．２ 植物类病毒脱除处理针对植物类病毒在植物体内分布不均匀、低温能够抑制类病毒增殖的特性，设计在低温条件下对植物进行处理加上茎尖分生组织培养，以脱去植物类病毒。４ 仪器和用具４．１ 仪器４．１．１ 超净工作台。４．１．２ 天平（０．００１ｇ）。１犛犖／犜２４７５—２０１０食品伙伴网４．１．３ 解剖镜。４．１．４ 光照培养箱。４．１．５ 高压灭菌锅。４．１．６ ｐＨ计或ｐＨ试纸。４．１．７ ＰＣＲ仪。４．１．８ 分子杂交箱。４．１．９ 电泳槽。４．２ 用具４．２．１ 量筒。４．２．２ 容量瓶。４．２．３ 接种针。４．２．４ 镊子。５ 类病毒检测方法５．１ 生物学检测（指示植物法）。５．２ 往返聚丙烯酰胺凝胶电泳ｒｅｔｕｒｎＰＡＧＥ。５．３ ＲＴＰＣＲ方法。５．４ 核酸杂交方法。６ 类病毒脱除处理程序６．１ 植株的低温处理将植株放在２℃～７℃条件下，在光照或黑暗条件下连续处理６个月以上。６．２ 材料剪取与灭菌剪取经过低温处理的植株茎尖１ｃｍ～２ｃｍ，自来水冲洗３０ｍｉｎ，剥去外面的叶片。将茎尖置于超净工作台上，无菌条件下进行消毒：７５％的乙醇浸泡１０ｓ，已灭菌的蒸馏水冲洗３次～５次；再用０．１％的升汞浸泡材料，滴入１滴～２滴吐温，消毒时间５ｍｉｎ～１５ｍｉｎ，用灭菌的蒸馏水冲洗３次～５次，每次５ｍｉｎ。将处理过的材料放入灭菌的培养皿中待用。６．３ 茎尖剥离与接种将经过上一步处理过的茎尖放在解剖镜下，用已灭菌的解剖刀逐层剥去幼叶，直至出现顶端分生组织，将顶端分生组织和毗邻的１个～２个幼叶原基切下，直立向上接种到适宜的固体培养基上。参见附录Ａ。６．４ 试管苗类病毒检测用上述类病毒的检测方法检测试管苗，如果检测结果为阴性则初步定为脱类病毒试管苗，进行后期的扩繁和生根移栽，如果检测结果为阳性则不是脱类病毒试管苗，需要再进一步进行类病毒脱除处理。６．５ 试管苗的扩繁与生根培养６．５．１ 试管苗的扩繁检测结果为阴性的试管苗可接种到扩繁培养基上进行增殖。６．５．２ 生根培养试管苗长至３ｃｍ～５ｃｍ时转至生根培养基进行培养。６．６ 试管苗的驯化将生长茁壮、有３片～５片叶的试管苗移至温室进行炼苗。２犛犖／犜２４７５—２０１０食品伙伴网６．７ 移栽６．７．１ 过渡培养取出试管苗，洗净根部培养基，移入适宜的栽培基质中，刚移栽后的试管苗要避光，湿度：８５％，温度：白天２５℃～２８℃，夜间１５℃～１８℃。避光保湿培养２ｄ～３ｄ后在正常的光照、温湿度条件下进行培养。６．７．２ 移入土壤过渡培养２周后，将生长茁壮的植株移入土壤。６．８ 移栽后植株的类病毒复检移栽后的脱类病毒植株长到一定大小需要进行类病毒复检，若复检结果与第一次结果相同，均为阴性，则可认定为脱类病毒苗；若复检结果与第一次结果不同，为阳性，则该再生苗不是脱类病毒苗，需要进一步进行类病毒脱除处理。６．９ 扩大繁殖经过上述过程，进行两次类病毒检测的无类病毒植株作为健康母株，进行扩大繁殖，完成整个类病毒脱除处理过程。犛犖／犜２４７５—２０１０食品伙伴网书书书犛犖／犜２４７５—２０１０附 录 犃（资料性附录）常见植物的类病毒脱除方法表犃．１植物种类常见类病毒检测方法类病毒脱除方法马铃薯马铃薯纺锤块茎类病毒（犘狅狋犪狋狅狊狆犻狀犱犾犲狋狌犫犲狉狏犻狉狅犻犱）①生物学检测（指示植物法）；②往返聚丙烯酰胺凝胶电泳ｒｅｔｕｒｎＰＡＧＥ；③ＲＴＰＣＲ方法；④核酸杂交方法低温处理结合茎尖培养：①马铃薯植株放在５℃条件下，每天给与１６ｈ，５０００ｌｘ的光照。处理时间为６个月，剥取茎尖；②马铃薯块茎放在６℃～７℃、黑暗条件下，处理时间为６个月，剥取茎尖菊花菊花矮化类病毒（犆犺狉狔狊犪狀狋犺犲犿狌犿狊狋狌狀狋狏犻狉狅犻犱）菊花褪绿斑驳类病毒（犆犺狉狔狊犪狀狋犺犲犿狌犿犮犺犾狅狉狅狋犻犮犿狅狋狋犾犲狏犻狉狅犻犱）①生物学检测（指示植物法）；②往返聚丙烯酰胺凝胶电泳ｒｅｔｕｒｎＰＡＧＥ；③ＲＴＰＣＲ方法；④核酸杂交方法低温处理结合茎尖培养：马铃薯植株放在５℃条件下，每天给与１６ｈ，５０００ｌｘ的光照。处理时间为６个月，剥取茎尖啤酒花啤酒花潜隐类病毒（犎狅狆犾犪狋犲狀狋狏犻狉狅犻犱）①生物学检测（指示植物法）；②往返聚丙烯酰胺凝胶电泳ｒｅｔｕｒｎＰＡＧＥ；③ＲＴＰＣＲ方法；④核酸杂交方法低温处理结合茎尖培养：啤酒花植株放在２℃～４℃、黑暗条件下，处理时间为８个月以上，剥取茎尖０１０２—５７４２犜／犖犛书号：１５５０６６·２２０７０８定价： １４．００元食品伙伴网