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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２４７３—２０１０芦笋枯萎病菌检疫鉴定方法犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犉狌狊犪狉犻狌犿狅狓狔狊狆狅狉狌犿犳．狊狆．犪狊狆犪狉犪犵犻２０１００１１０发布２０１００７１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布食品伙伴网书书书前 言 本标准的附录Ａ、附录Ｂ和附录Ｃ均为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准主要起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：程颖慧、章桂明、王颖、龙海、徐浪、郑耘、杨伟东、陈枝楠、谭彦彩。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２４７３—２０１０食品伙伴网芦笋枯萎病菌检疫鉴定方法１ 范围本标准规定了芦笋（犃狊狆犪狉犪犵狌狊狅犳犳犻犮犻狀犪犾犻狊Ｌｉｎｎ）种子及新鲜芦笋组织上的芦笋枯萎病菌（犉狌狊犪狉犻狌犿狅狓狔狊狆狅狉狌犿犛犮犺犾犲犮犺狋．ｆ．ｓｐ．犪狊狆犪狉犪犵犻Ｃｏｈｅｎ＆Ｈｅａｌｄ）的检疫和鉴定方法。本标准适用于对来自芦笋枯萎病疫区的芦笋种子和新鲜芦笋组织的检疫。２ 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＳＮ／Ｔ１８０９ 进出境植物种子检疫规程ＳＮ／Ｔ２１２２ 进出境植物及植物产品检疫抽样３ 原理３．１ 分类学地位英文名：ＦｕｓａｒｉｕｍＷｉｌｔｏｆＡｓｐａｒａｇｕｓ学名：犉狌狊犪狉犻狌犿狅狓狔狊狆狅狉狌犿Ｓｃｈｌｅｃｈｔ．ｆ．ｓｐ．犪狊狆犪狉犪犵犻ＣｏｈｅｎａｎｄＨｅａｌｄ１９４１芦笋枯萎病菌属真菌界（Ｆｕｎｇｉ），有丝分裂孢子真菌［１］（Ｍｉｔｏｓｐｏｒｉｃｆｕｎｇｉ）、丝孢菌纲（Ｈｙｐｈｏｍｙｃｅｔｅｓ），丛梗孢目（Ｍｏｎｉｌａｌｅｓ），瘤座孢科（Ｔｕｂｅｒｃｕｌａｒｉａｃｅａｅ），镰刀菌属（犉狌狊犪狉犻狌犿）。３．２ 鉴定原理该真菌可以通过种子传播，其为害症状、形态特征、培养性状、寄主范围等特征是其鉴定的依据。依照这些特征能将该菌与其他真菌尤其是与芦笋上的其他致病镰刀菌区别开来。４ 仪器和用具４．１ 仪器体视显微镜、光学显微镜（带显微照相装置）、测微尺、天平（感量０．１ｇ）、超净工作台、光照培养箱或光照培养架等。４．２ 用具紫外灯管、手持放大镜、滤纸、烧杯、培养皿、三角瓶、镊子、剪刀、载玻片、盖玻片、量筒、酒精灯、吸管等。５ 试剂和培养基５．１ 试剂琼脂粉、蔗糖、无菌水、１．２５％次氯酸钠（ＮａＣｌＯ）、７５％酒精、蛋白胨、磷酸二氢钾（ＫＨ２ＰＯ４）、硫酸镁（ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ）、硫酸链霉素、硫酸新霉素、腈菌唑等。５．２ 培养基马铃薯蔗糖培养基（ＰＳＡ）、腈菌唑培养基（ＭＢＡ）和马铃薯葡萄糖培养基（ＰＤＡ）。６ 现场抽样按照ＳＮ／Ｔ１８０９及ＳＮ／Ｔ２１２２规定进行取样。１犛犖／犜２４７３—２０１０食品伙伴网７ 实验室检验７．１ 症状检查受侵染的植株的症状参见附录Ａ第Ａ．３章。７．２ 保湿培养７．２．１ 种子保湿培养将检验样品用有效成分为１．２５％的次氯酸钠（ＮａＣｌＯ）溶液表面灭菌３ｍｉｎ～４ｍｉｎ后，用灭菌水洗涤两次，放在垫有３层已灭菌湿滤纸的培养皿中，每皿１０粒，在２０℃～２２℃下放置２４ｈ后，－２０℃冷冻２４ｈ，转至２５℃培养箱或培养架上培养，黑暗和紫外光照各１２ｈ交替，１４ｄ后观察种子上是否出现白色菌丝或霉状物。药剂处理过的种子需先洗去表面的种衣剂，再按照上述方法保湿培养。７．２．２ 新鲜植物组织保湿培养取待检样品的茎切成１ｃｍ长的小段，冲洗掉表面的泥土杂物后，在７５％的酒精溶液中浸泡１ｍｉｎ，经灭菌水洗涤后，用灭菌解剖刀横切成长度为１ｍｍ～４ｍｍ的小片，放置在垫有３层灭菌湿滤纸的培养皿中，每皿５片～１０片，转至２５℃培养箱或培养架上培养，黑暗和紫外光照各１２ｈ交替，观察植物残体表面是否出现白色菌丝或霉状物。７．３ 分离培养性状保湿培养发现疑似带病种子或组织，表面消毒后置于ＭＢＡ培养基上，２０℃黑暗条件下培养５ｄ以上，培养基表面生长出白色菌丝，菌丝生长速度慢，菌落小。取ＭＢＡ培养基上生长的培养物，置于ＰＳＡ培养基上，２０℃黑暗条件下培养４ｄ～５ｄ，气生菌丝绒状，白色、粉色至淡青色，基物表面淡青色。有时产生蓝绿色菌丝团。培养基配方参见附录Ｂ。７．４ 形态学特征在显微镜下观查，菌丝体纤细，小型分生孢子着生于单出瓶状小梗上，假头状着生，通常生长茂盛，可变异，数量多，卵形至椭圆形，平直或弯曲，大小为（５μｍ～１２μｍ）×（２．５μｍ～３．５μｍ）。大型分生孢子着生于分支的分生孢子梗上，薄壁，通常具有３个～５个分隔，镰型，具钩状的顶端，在基部有小柄，大小：３个分隔（２７μｍ～４６μｍ）×（３μｍ～５μｍ）；５个分隔（３５μｍ～６０μｍ）×（３μｍ～５μｍ）。厚垣孢子，间生或顶生，多单独生长，偶尔也可以对生或串生，球形，直径６μｍ～８μｍ。参见附录Ｃ。该病菌与其他几个近似种的形态学上的比较见表１。表１ 芦笋上的三种镰刀菌形态学特征比较表比较项目犉．狅狓狔狊狆狅狉狌犿ｆ．ｓｐ．犪狊狆犪狉犪犵犻犉．狉犲犱狅犾犲狀狊犉．犿狅狀犻犾犻犳狅狉犿犲培养性状培养４ｄ～５ｄ，菌落直径约２．５ｃｍ～４．５ｃｍ，气生菌丝绒状，白色、粉色至淡青色，基物表面淡青色，基物无色。有时产生蓝绿色菌丝团。气生菌丝绒状至粉状，菌落灰色至微红褐色或浅褐色，菌落较平坦。培养４ｄ～５ｄ，菌落直径约３．２ｃｍ～４ｃｍ，气生菌丝绒状至粉状，白色、至淡牵牛紫，有时产生桔橙色分生孢子座。基物表面淡牵牛紫，培养基不变色。大型分生孢子着生于分支的分生孢子梗上，薄壁，通常具有３个～５个分隔，镰型，具钩状的顶端，在基部有小柄，大小：３个分隔（２７μｍ～４６μｍ）×（３μｍ～５μｍ）；５个分隔（３５μｍ～６０μｍ）×（３μｍ～５μｍ）。形成于分生孢子梗上或粘孢团层上，镰刀型，有足细胞，大型分生孢子大小为（２０μｍ～５５μｍ）×（４．５μｍ～５．５μｍ）。镰刀型，细长，顶胞渐尖，基胞足跟明显至不明显，隔膜易消解，３个～５个分隔，多数３隔，（２５μｍ～５５μｍ）×（３μｍ～４．５μｍ）。２犛犖／犜２４７３—２０１０食品伙伴网表１（续）比较项目犉．狅狓狔狊狆狅狉狌犿ｆ．ｓｐ．犪狊狆犪狉犪犵犻犉．狉犲犱狅犾犲狀狊犉．犿狅狀犻犾犻犳狅狉犿犲小型分生孢子着生于单出瓶状小梗上，假头状着生，通常生长茂盛，可变异，数量多，卵形至椭圆形，平直或弯曲，大小为（５μｍ～１２μｍ）×（２．５μｍ～３．５μｍ）。数量多，卵形或圆柱形，略微弯曲，端部有节点。大小为（７μｍ～１４μｍ）×（３μｍ～４μｍ）。数量多，卵形至椭圆形，在产孢细胞上串生，单瓶梗，也有假头生，（７μｍ～１５μｍ）×（２μｍ～３μｍ）。厚垣孢子间生或顶生，数量较多，多单独生长，偶尔也可以对生或串生，球形，直径６μｍ～８μｍ。间生或顶生，球形或椭圆形，直径７μｍ～１１μｍ。未见。７．５ 致病性测定将粟米与水（２∶１，体积比）连续湿热灭菌两次，每次１ｈ，冷却后接种分离物于其中，２０℃培养３周风干，加入土中（１ｋｇ土壤中加８ｇ粟米培养物）拌匀，种植苗龄为１３周的芦笋幼苗于其中，２０℃、９ｈ光照条件下种植８周后，检查植株有无发病，并再次从病部分离病原菌，观察其形态是否与７．４一致。８ 结果判定如分离物的各种形态特征与７．３、７．４描述的芦笋枯萎病菌培养性状和形态特征相吻合，且致病性测定结果符合芦笋枯萎病症状特征且重新分离获得的病原菌形态学特征与７．４描述吻合，可判定为芦笋枯萎病菌。９ 样品保存如发现芦笋枯萎病菌，该样品至少保存６个月，以备复验、谈判和仲裁。保存期满后，需经灭菌处理。１０ 菌种保存分离到的芦笋枯萎病菌菌种，转入ＰＤＡ试管斜面培养基上，置于５℃黑暗条件下保存至少１２个月，以备复验、谈判和仲裁。３犛犖／犜２４７３—２０１０食品伙伴网附 录 犃（资料性附录）芦笋枯萎病菌的分布、寄主、症状及生物学特性犃．１ 分布德国、荷兰、法国、意大利、比利时、西班牙、希腊、坦桑尼亚、南非、澳大利亚、新西兰、加拿大、美国、日本、中国（台湾）。犃．２ 寄主芦笋（犃狊狆犪狉犪犵狌狊狅犳犳犻犮犻狀犪犾犻狊Ｌｉｎｎ）。犃．３ 症状发病植株表现为黄化矮小、凋萎而枯死。病菌侵染芦笋的营养根，表皮呈红棕色病斑或者凹陷的褐色病斑，根茎部维管束变褐色，地面植株上部呈黄化、矮化、凋萎、落叶或枯死状。幼笋期染病，幼笋细小或难以出土，嫩茎染病，茎基部变褐或纵裂，拟叶凋萎。潮湿时表面出现白色至粉红色薄霉层病征（病菌分生孢子梗及分生孢子）。犃．４ 生物学特征病菌依靠带菌种子、种苗和病残体进行远距离传播，在田间主要通过芦笋潜叶蝇（犗狆犺犻狅犿狔犻犪狊犻犿狆犾犲狓）、风雨和流水进行传播。病原菌长期栖息于土壤中，能大量繁殖，抗逆性强。通过寄主植株根部自然孔口或伤口侵染植株，发病后产生大量的分生孢子进行再侵染。４犛犖／犜２４７３—２０１０食品伙伴网附 录 犅（资料性附录）培养基配方犅．１ 犕犅犃培养基配方（１犔）蛋白胨２０ｇ磷酸二氢钾（ＫＨ２ＰＯ４）１ｇ硫酸镁（ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ）０．５ｇ琼脂２０ｇ硫酸链霉素（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎｓｕｌｐｈａｔｅ）１００ｍｇ硫酸新霉素（ｎｅｏｍｙｃｉｎｓｕｌｐｈａｔｅ）１２ｍｇ腈菌唑（ｍｙｃｌｏｂｕｔａｎｉｌ）２００ｍｇ犅．２ 犘犛犃培养基配方（１犔）马铃薯２００ｇ蔗糖２０ｇ琼脂２０ｇ犅．３ 制作方法将配方中的各成分加水煮沸溶解后，补水至１０００ｍＬ，ｐＨ值调到７．２～７．４，分装后１２１℃１５ｌｂ湿热灭菌２０ｍｉｎ。５犛犖／犜２４７３—２０１０食品伙伴网附 录 犆（资料性附录）犉．狅狓狔狊狆狅狉狌犿形态特征图 Ａ———大型分生孢子；Ｂ———小型分生孢子；Ｃ———厚垣孢子；Ｄ———产孢细胞。（仿 陈鸿逵，１９９２）图犆．１ 犉．狅狓狔狊狆狅狉狌犿形态特征图６犛犖／犜２４７３—２０１０食品伙伴网书书书０１０２—３７４２犜／犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准芦笋枯萎病菌检疫鉴定方法ＳＮ／Ｔ２４７３—２０１０中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６ ６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６ 印张０．７５ 字数１３千字２０１０年４月第一版 ２０１０年４月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２０７０６ 定价１６．００元食品伙伴网