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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２４９７．１１—２０１０进出口危险化学品安全试验方法第１１部分：种系突变试验犜犲狊狋犿犲狋犺狅犱狅犳犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋犱犪狀犵犲狉狅狌狊犮犺犲犿犻犮犪犾狊—犘犪狉狋１１：犌犲狉犿犾犻狀犲犿狌狋犪狋犻狅狀２０１００３０２发布２０１００９１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 ＳＮ／Ｔ２４９７《进出口危险化学品安全试验方法》系列标准共分为２９部分：———第１部分：体内哺乳动物肝细胞程序外ＤＮＡ合成（ＵＤＳ）试验；———第２部分：空斑形成细胞（ＰＦＣ）试验；———第３部分：大型蟤繁殖试验；———第４部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验；———第５部分：睾丸细胞ＵＤＳ试验；———第６部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验；———第７部分：小鼠耳肿胀试验；———第８部分：窝淋巴结试验；———第９部分：血清溶血素测定试验；———第１０部分：Ｔ淋巴细胞增殖功能测定试验；———第１１部分：种系突变试验；———第１２部分：单细胞凝胶电泳分析试验；———第１３部分：荧光原位杂交试验；———第１４部分：ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳试验；———第１５部分：ＰＣＲＳＳＣＰ实验；———第１６部分：ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ实验；———第１７部分：哺乳动物行为毒理学试验；———第１８部分：ＤＮＡ加合物的检测方法；———第１９部分：ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ实验；———第２０部分：Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定蛋白质含量；———第２１部分：琼脂糖凝胶电泳试验；———第２２部分：ＤＮＡ的Ｔｍ值测定方法；———第２３部分：细胞器的分离实验方法；———第２４部分：细胞免疫功能体外检测方法；———第２５部分：体液免疫功能试验；———第２６部分：巨噬细胞功能试验；———第２７部分：流式细胞术检测凋亡；———第２８部分：穿梭质粒在突变检验中的应用；———第２９部分：生化需氧量（ＢＯＤ）测定。本部分为ＳＮ／Ｔ２４９７系列标准的第１１部分。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分负责起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国湖南出入境检验检疫局。本部分主要起草人：张园、王利兵、熊中强、赵琢、李学洋、庞震。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２４９７．１１—２０１０进出口危险化学品安全试验方法第１１部分：种系突变试验１ 范围ＳＮ／Ｔ２４９７的本部分规定了进出口危险化学品安全试验中种系突变试验的试剂和器材、试验方法、试验步骤、试验结果和试验报告。本部分适用于进出口危险化学品种系突变试验。２ 规范性引用文件下列文件中的条款通过ＳＮ／Ｔ２４９７的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。ＧＢ１４９２４．１ 实验动物 配合饲料通用质量标准ＧＢ１４９２５ 实验动物 环境及实施消毒技术规范３ 试剂和器材３．１ 试剂３．１．１ ０．９％氯化钠溶液。３．１．２ ０．０７５ｍｏｌ／Ｌ氯化钾溶液。３．１．３ １％高碘酸溶液：１ｇ高碘酸溶解在１００ｍＬ二次水中，４℃冰箱保存。３．１．４ 磷酸缓盐冲液（ｐＨ７．４）：配制方法见《消毒技术规范》２．３．８．２．２（９）。３．１．５ 睾丸细胞分离液（ＴＩＭ）：取ＮａＣｌ６．０ｇ，ＫＣｌ３．３ｇ，ＣａＣｌ２·２Ｈ２Ｏ０．１８ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０．３ｇ，Ｎａ２ＨＰＯ４０．８５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４０．０９ｇ，葡萄糖１０ｇ，０．５％酚红溶液０．８ｍＬ，加蒸馏水溶解至１Ｌ，ｐＨ为７．２～７．３，４℃保存。３．１．６ Ｚｅｎｋｅｒｔ液：称量Ｋ２Ｃｒ２Ｏ７２５ｇ，Ｎａ２ＳＯ４·１０Ｈ２Ｏ１０ｇ，加Ｈ２Ｏ溶解至１０００ｍＬ。３．１．７ Ｈｅｌｌｅｙ氏固定液：临用前，加入甲醛溶液（３６％～４０％）５０ｍＬ到９５０ｍＬＺｅｎｋｅｒｔ液中。３．１．８ １０％甲醛固定液：１份甲醛溶液（３６％～４０％）与３份双蒸水混合。３．１．９ Ｓｃｈｉｆｆｓ液：１ｇ碱性品红溶于２００ｍＬ刚沸腾过的蒸馏水中（注意放碱性品红时不要在沸腾时放入），震荡５ｍｉｎ，待溶液冷却至５０℃，粗滤纸过滤，在滤液中加入１ｍｏｌ／Ｌ盐酸２０ｍＬ，待冷却到２５℃时，加入１ｇ偏重亚硫酸钠，溶解后冷却至室温，室温避光２４ｈ，加新鲜活性碳２ｇ充分摇荡数分钟，滤纸过滤，于４℃冰箱保存。３．１．１０ 哈瑞氏苏木素液：甲液（１ｇ苏木精溶于无水酒精１０ｍＬ中），乙液（钾明钒２０ｇ溶于２００ｍＬ蒸馏水中），先将乙液煮沸后去火，缓慢加入已溶解的甲液，后立即缓慢加入０．５ｇ氧化汞，再次煮沸，迅速冷却后加入纯冰醋酸８ｍＬ过滤使用（注意：在加入氧化汞和钾明钒时要缓慢，注意安全）。３．２ 仪器和器材实验室常用设备、生物显微镜、恒温水浴箱３７℃±５℃、离心机、解剖剪、镊子、注射器、灌胃针头、离心管、吸管、滴管、试管架、载玻片、塑料吸瓶、干净纱布、滤纸等。１犛犖／犜２４９７．１１—２０１０４ 试验方法４．１ 试验动物成年小鼠（体重２５ｇ～３０ｇ），或大鼠（体重１８０ｇ～２２０ｇ）。动物总数不少于３０只，雌雄各半。试验动物饲养条件应符合ＧＢ１４９２４．１和ＧＢ１４９２５有关规定。４．２ 受试物溶剂通常采用蒸馏水、等渗盐水、植物油、食用淀粉、羧甲基纤维素钠等。如使用特殊溶剂或载体，应有参考资料说明其成分。４．３ 剂量分组应进行预试验以选择最高剂量，为避免出现假阴性结果应适当增大剂量范围。如果受试样品具有毒性，应在第一个采样时间点设三个剂量，设置的剂量应包括从最大毒性至最小毒性或无毒性的范围。第二次采样时间点仅需设置最高剂量。按等比级数２向下设置中、低剂量组。５ 试验步骤５．１．１ 限度试验如果单次染毒剂量不小于２０００ｍｇ／ｋｇ，未出现毒性效应，且根据资料预期受试物无遗传毒性，则不需要进行其他染毒剂量的试验。５．１．２ 染毒一般情况下染毒—次，或者为便于大容量给药，也可分散剂量染毒，即同一日染毒两次，其间隔时间不超过几小时。高剂量组动物分为Ａ、Ｂ两个亚组，分两次采集样品，啮齿类动物采样时间一般为１．５个正常期中的间隔期，即Ａ组于末次染毒后１２ｈ～１８ｈ采集样品。Ｂ组于末次染毒后３６ｈ～４２ｈ采集样品；中、低剂量组均于末次染毒后１２ｈ～１８ｈ采集样品。如果采用多次染毒方式，只需在最后一次染毒后１２ｈ～１８ｈ采一次样。５．１．３ 制备细胞混悬液用颈椎脱臼法处死动物，迅速摘取一侧睾丸，用ＴＩＭ液冲去血污，置于小平皿中，去除白膜，将曲细精管剪成碎段，加入３ｍＬＴＩＭ液的反复吹打后，经铜网过滤到５ｍＬ离心管中，以１５００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃上清，加ＴＩＭ液洗涤细胞２次，再加１．５ｍＬ的ＴＩＭ液制成细胞混悬液。５．１．４ 固定取细胞混悬液于洁净玻片上滴片，每只动物制片两张，静置５ｍｉｎ后，滴加Ｈｅｌｌｙ氏固定液数滴预固定１０ｍｉｎ，染缸中Ｈｅｌｌｙ氏液再固定１ｈ，用７０％乙醇冲洗几次后，放到７０％乙醇待染。５．１．５ 染色将有细胞的玻片用蒸馏水冲洗几次后，１％高碘酸浸泡１０ｍｉｎ，Ｓｃｈｉｆｆ’ｓ液浸泡１０ｍｉｎ，自来水冲洗５ｍｉｎ，蒸馏水冲洗２次，１５％苏木素染色５ｍｉｎ，自来水冲洗５ｍｉｎ，蒸馏水冲洗２次，用１％盐酸酒精中分色７０ｓ，自来水浸泡１０ｍｉｎ，蒸馏水冲洗２次，依次用５０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９５％、１００％、１００％酒精脱水，酒精二甲苯透明，二甲苯透明，树胶封片，镜检。６ 试验结果６．１ 阅片———所有玻片，包括阳性对照和阴性对照，在镜检前要分别编号。———在低倍镜下检查制片质量，制片应全部染色体较集中，而各个染色体分散、互不重叠、长短收缩适中、两单体分开、清晰地显示出着丝点位置、染色体呈红紫色。用油镜进行细胞染色体中期分析。２犛犖／犜２４９７．１１—２０１０———确定有丝分裂指数：包括所有处理组、阴性对照组和阳性对照组（每只动物计数１０００个细胞）。———计数畸变细胞：用双盲法阅片。每只动物至少分析１００个分散良好的中期分裂相细胞，每个剂量组不少于１０００个中期分裂相细胞。在阅片时应记录每一观察细胞的染色体数目，对于畸变细胞还应记录显微镜视野的坐标位置及畸变类型。６．２ 观察项目染色体数目的改变：非整倍体（亚二倍体或超二倍体），多倍体，内复制。染色体结构的改变：断裂、微小体、有着丝点环、无着丝点环、单体互换、双微小体、裂隙和非特定性型变化（如粉碎化、着丝点细长化、粘着等）。７ 试验报告试验报告应包括以下内容：———受试物：鉴定资料和ＣＡＳ编号（如已知）；物理性质和纯度；与进行本试验有关的物理化学性质，受试物的稳定性（如已知）。———溶剂／赋形剂：溶剂／赋形剂选择依据；受试物在溶剂／赋形剂中的溶解性和稳定性（如已知）。———试验动物；所用动物的品系；动物的数量、畜龄和性别；来源、饲养条件、饲料等；在试验开始时动物的个体体重，包括每组的体重范围、均数和标准差。———试验条件：阳性对照和阴性（溶剂／赋形剂）对照；有关剂量设置的预试验资料（如进行）；剂量水平选择的理由；受试物染毒的细节；染毒途径的选择理由；细胞悬液的制备方法；制片的方法；阅片观察记录；评价标准；结果判断的标准。———结果：畸变细胞数目；染色体数目改变；染色体结构的改变。———结果讨论。———结论。犛犖／犜２４９７．１１—２０１０书书书０１０２—１１．７９４２犜／犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准进出口危险化学品安全试验方法第１１部分：种系突变试验ＳＮ／Ｔ２４９７．１１—２０１０中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６ ６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６ 印张０．５ 字数８千字２０１０年６月第一版 ２０１０年６月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２０９４４ 定价１４．００元