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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２４９７．１２—２０１０进出口危险化学品安全试验方法第１２部分：单细胞凝胶电泳分析试验犜犲狊狋犿犲狋犺狅犱狅犳犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋犱犪狀犵犲狉狅狌狊犮犺犲犿犻犮犪犾狊—犘犪狉狋１２：犛犻狀犵犾犲犮犲犾犾犵犲犾犲犾犲犮狋狉狅狆犺狅狉犲狊犻狊（犛犆犌犈）犪狊狊犪狔２０１００３０２发布２０１００９１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 ＳＮ／Ｔ２４９７《进出口危险化学品安全试验方法》系列标准共分为２９部分：———第１部分：体内哺乳动物肝细胞程序外ＤＮＡ合成（ＵＤＳ）试验；———第２部分：空斑形成细胞（ＰＦＣ）试验；———第３部分：大型溞繁殖试验；———第４部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验；———第５部分：睾丸细胞ＵＤＳ试验；———第６部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验；———第７部分：小鼠耳肿胀试验；———第８部分：腘窝淋巴结试验；———第９部分：血清溶血素测定试验；———第１０部分：Ｔ淋巴细胞增殖功能测定试验；———第１１部分：种系突变试验；———第１２部分：单细胞凝胶电泳分析试验；———第１３部分：荧光原位杂交试验；———第１４部分：ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳试验；———第１５部分：ＰＣＲＳＳＣＰ实验；———第１６部分：ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ实验；———第１７部分：哺乳动物行为毒理学试验；———第１８部分：ＤＮＡ加合物的检测方法；———第１９部分：ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ实验；———第２０部分：Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定蛋白质含量；———第２１部分：琼脂糖凝胶电泳试验；———第２２部分：ＤＮＡ的Ｔｍ值测定方法；———第２３部分：细胞器的分离实验方法；———第２４部分：细胞免疫功能体外检测方法；———第２５部分：体液免疫功能试验；———第２６部分：巨噬细胞功能试验；———第２７部分：流式细胞术检测凋亡；———第２８部分：穿梭质粒在突变检验中的应用；———第２９部分：生化需氧量（ＢＯＤ）测定。本部分为ＳＮ／Ｔ２４９７系列标准的第１２部分。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分负责起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国湖南出入境检验检疫局。本部分主要起草人：张园、王利兵、王华、赵琢、韩伟、熊中强。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２４９７．１２—２０１０进出口危险化学品安全试验方法第１２部分：单细胞凝胶电泳分析试验１ 范围ＳＮ／Ｔ２４９７的本部分规定了进出口危险化学品的单细胞凝胶电泳分析试验的试验方法、试验步骤、试验结果和结果报告。本部分适用于进出口危险化学品单细胞凝胶电泳分析试验。２ 规范性引用文件下列文件中的条款通过ＳＮ／Ｔ２４９７的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的文件，其最新版本适用于本部分。ＧＢ１４９２４．１ 实验动物 配合饲料通用质量标准ＧＢ１４９２５ 实验动物 环境及实施３ 术语、定义和缩略语３．１ 术语和定义下列术语和定义适用于本部分。３．１．１裂解 犾狔狊犻狊采用高盐和去垢剂破除细胞膜，去除蛋白，是ＤＮＡ片段在电场力的作用下能够从细胞核迁出。３．１．２解旋 狌狀狑犻狀犱犻狀犵ＤＮＡ为双螺旋结构，在解旋液的作用下，双链ＤＮＡ变性，成为单链。３．２ 缩略语下列缩略语适用于本部分。３．２．１ 犇犕犛犗犇犻犿犲狋犺狔犾狊狌犾犳狅狓犻犱犲 二甲基亚砜３．２．２ 犇犖犃犇犲狅狓狔狉犻犫狅狀狌犮犾犲犻犮犪犮犻犱 脱氧核糖核酸３．２．３ 犈犅犈狋犺犻犱犻狌犿犫狉狅犿犻犱犲 溴化乙锭３．２．４ 犘犅犛 磷酸盐缓冲液３．２．５ 犘犐犘狉狅狆犻犱犻狌犿犻狅犱犻犱犲 碘化丙啶４ 原理ＤＮＡ分子在断裂剂作用下出现链断裂，将单个核细胞包埋于琼脂糖凝胶中，细胞经裂解和解旋后１犛犖／犜２４９７．１２—２０１０电泳，在电场作用下，ＤＮＡ片断向阳极迁移，移动的距离与ＤＮＡ片断的相对分子质量和电荷数相关，经荧光染料染色后在荧光显微镜下可观察到彗星样图像，根据慧星拖尾长度及荧光强度可进行ＤＮＡ损伤分析。５ 主要试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水为灭菌去离子水或超纯水。５．１ ＰＢＳ：在８００ｍＬ蒸馏水中溶解８ｇＮａＣｌ，０．２ｇＫＣｌ，１．４４ｇＮａ２ＨＰＯ４和０．２４ｇＫＨ２ＰＯ４，用ＨＣｌ调节溶液的ｐＨ值至７．４，加水定容至１Ｌ，在１．０３４×１０５Ｐａ（１５１ｂｆ／ｉｎ２）高压下灭菌２０ｍｉｎ，保存于室温０．７％正常熔点凝胶（ＰＢＳ配制）。５．２ ０．７％低熔点凝胶（ＰＢＳ配制）。５．３ １％正常熔点凝胶（ＰＢＳ配制）。５．４ 碱性裂解液：２．５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ；１００ｍｍｏｌ／ＬＮａ２ＥＤＴＡ；１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ；１％肌氨酸钠，临用前加终浓度为１０％ＤＭＳＯ，１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００，预冷。５．５ 电泳缓冲液：１ｍｍｏｌ／ＬＮａ２ＥＤＴＡ；３００ｍｍｏｌ／ＬＮａＯＨ。５．６ 中和缓冲液：Ｔｒｉｓ·Ｃｌ，ｐＨ７．２。５．７ 荧光染料：可选用ＥＢ、吖啶橙和ＰＩ等，荧光染料多具有致癌和致畸作用，应注意防护。５．８ 全磨砂载玻片。５．９ 盖玻片。６ 主要仪器设备６．１ 电泳设备。６．２ 荧光显微镜。７ 试验方法７．１ 试验动物首选为大鼠或小鼠，常用的体重范围是大鼠１８０ｇ～２４０ｇ，小鼠１８ｇ～２５ｇ。试验动物饲养条件应符合ＧＢ１４９２４．１和ＧＢ１４９２５有关规定。７．２ 受试物受试物应溶于或悬浮于适当的溶剂或赋形剂，并于染毒前稀释。溶剂或赋形剂在所用剂量水平不应产生毒效应，不应与受试物反应。推荐首先考虑使用水性溶剂或赋形剂。７．３ 剂量分组通常至少应设高、中、低３个剂量组，最高剂量应产生ＤＮＡ损伤，且不应导致动物死亡。同时还应设置溶剂或赋形剂对照组和阳性对照组。８ 试验步骤８．１ 染毒受试物通常用灌胃或腹腔注射染毒，也可根据受试物实际接触途径采用其他适合的染毒途径。一次灌胃或注射染毒的最大液体容积应不超过２ｍＬ／１００ｇ。可根据受试物现有毒理学资料，确定染毒方式和时间。８．２ 单细胞悬液制备染毒结束后，取动物组织或脏器，采用研磨法或酶消化法，制备成单细胞悬液，浓度为１×１０６个／ｍＬ。８．３ 制胶ａ） 铺１００μＬ１％正常熔点琼脂糖凝胶于全磨砂载玻片上，盖上盖玻片，冷凝１０ｍｉｎ；２犛犖／犜２４９７．１２—２０１０ｂ） 取下盖玻片，铺１００μＬ含单细胞悬液的０．７％低熔点琼脂糖，盖上盖玻片，冷凝１０ｍｉｎ；ｃ） 取下盖玻片，铺１００μＬ１％正常熔点琼脂糖，盖上盖玻片，冷凝１０ｍｉｎ（第三层胶可视具体情况不进行制备）。８．４ 裂解将制备胶的载玻片去掉盖玻片后，浸于４℃预冷的细胞裂解液中，４℃裂解１ｈ～１．５ｈ。８．５ 解旋取出载玻片，放入电泳槽中，浸泡在电泳液中解旋２０ｍｉｎ。８．６ 电泳电流３００ｍＡ，电压２５Ｖ的条件下２５ｍｉｎ，通过调节电泳缓冲液容积调节电压和电流。８．７ 中和取出载玻片，用中和缓冲液漂洗３次。８．８ 染色载玻片上滴加适当荧光染料，加盖盖玻片，暗处染色２０ｍｉｎ。８．９ 镜检在荧光显微镜下采用适宜波长进行观察、照相。９ 试验结果９．１ 镜下每张片随机计数１００个细胞，计算彗星细胞出现频率，也可根据每个细胞拖尾占其体积的百分率对ＤＮＡ损伤程度进行主观分级评分，见表１。表１ 对犇犖犃损伤程度的分级评分ＤＮＡ损伤分级损伤程度０级———无损伤＜５％，细胞无拖尾，只有一个圆形细胞核形成的荧光头Ⅰ级———低损伤５％～２０％，有少量拖尾Ⅱ级———中度损伤２０％～４０％，出现明显拖尾Ⅲ级———高度损伤４０％～９５％，出现严重拖尾Ⅳ级———完全损伤＞９５％，细胞受损严重，成为片段９．２ 采用目镜测微尺，每片计数（２５～５０）个细胞，每组（２～３）张玻片，测头长与全长，计算拖尾率。９．３ 采用专业的单细胞凝胶电泳试验分析软件对图像进行分析。１０ 试验报告试验报告应包括下列资料：———受试物：鉴定资料和ＣＡＳ编号（如已知）；物理性质和纯度；与进行本试验有关的物理化学性质，受试物的稳定性（如已知）。———溶剂或赋形剂：溶剂或赋形剂选择依据；受试物在溶剂或赋形剂中的溶解性和稳定性（如已知）。———试验动物：所用动物的品系；动物的数量、畜龄、性别、来源等；在试验开始时动物的个体体重，包括每组的体重范围、均数和标准差。———试验条件：阳性对照和阴性（溶剂或赋形剂）对照；有关剂量设置的预试验资料（如进行）；剂量水平；染毒途径；染毒时间；单细胞悬液制备方法；结果记录方法，评价标准。———试验结果：每张片计数细胞个数；出现彗星细胞个数；根据不同分析方法的结果分析。———结果的讨论。———结论。犛犖／犜２４９７．１２—２０１０书书书０１０２—２１．７９４２犜／犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准进出口危险化学品安全试验方法第１２部分：单细胞凝胶电泳分析试验ＳＮ／Ｔ２４９７．１２—２０１０中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６ ６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６ 印张０．５ 字数６千字２０１０年６月第一版 ２０１０年６月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２０９４５ 定价１４．００元