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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２４７２—２０１０日本乙型脑炎检疫技术规范犘狉狅狋狅犮狅犾狅犳狇狌犪狉犪狀狋犻狀犲狋犲犮犺狀犻狇狌犲犳狅狉犑犪狆犪狀犲狊犲犲狀犮犲狆犺犪犾犻狋犻狊２０１００１１０发布２０１００７１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书目 次前言Ⅰ…………………………………………………………………………………………………………１ 范围１………………………………………………………………………………………………………２ 规范性引用文件１…………………………………………………………………………………………３ 概述１………………………………………………………………………………………………………４ 诊断技术１…………………………………………………………………………………………………５ 综合判定１５…………………………………………………………………………………………………附录Ａ（规范性附录） 试剂配制１６…………………………………………………………………………附录Ｂ（规范性附录） 感染乳鼠脑组织制备血凝素抗原１９………………………………………………犛犖／犜２４７２—２０１０前 言 本标准的附录Ａ、附录Ｂ均为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准的起草单位：中华人民共和国吉林出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本标准主要起草人：石建平、孟日增、肖成蕊、王伟利、李树清。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２４７２—２０１０日本乙型脑炎检疫技术规范１ 范围本标准规定了日本乙型脑炎病毒的分离与鉴定、ＲＴＰＣＲ方法、乳胶凝集试验、间接免疫荧光试验、蚀斑减数试验、血凝抑制试验、补体结合试验等实验室检疫技术规范。本标准适用于马属动物和猪日本乙型脑炎的诊断与检疫。２ 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为该标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法３ 概述日本乙型脑炎（Ｊａｎｐａｎｅｓｅｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）又名流行性乙型脑炎，简称乙脑，是由日本乙型脑炎病毒引起的一种急性人兽共患传染病。蚊虫为传播媒介。在人和马呈现脑炎症状，猪表现流产、死胎和睾丸炎，其他家畜和家禽大多呈隐性感染。有明显的季节性。本病分布很广，主要存在亚洲地区，给人畜健康和国民经济造成很大的危害和损失。引起本病的病原体为日本乙型脑炎病毒（Ｊａｐａｎｅｓｅｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓｖｉｒｕｓ）属于黄病毒科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、黄病毒属（犉犾犪狏犻狏犻狉狌狊），是一种球形单股ＲＮＡ病毒，病毒粒子呈球形，有脂蛋白的囊膜，囊膜上有纤突，具有血凝活性，能凝集鸡、鸭、鹅及绵羊红细胞。病毒对外界抵抗力不强，对化学药品较敏感，常用消毒药都有良好的灭活作用，对胰酶、乙醚、三氯甲烷等亦敏感。小鼠是最常用来分离和繁殖病毒的实验动物，各种日龄的小鼠都有感受性，但以１日龄～３日龄的乳鼠最易感。小鼠脑内接种病料后经２ｄ～４ｄ开始发病，表现松毛，失去光泽并于１ｄ～２ｄ内死亡。３～４周龄的小鼠经脑接种后４ｄ～１０ｄ发病。大鼠亦可感染发病。豚鼠、兔、鸡都不易感。病毒最适宜在鸡胚卵黄囊内繁殖，此外病毒亦可在鸡胚成纤维细胞、猪肾或仓鼠肾细胞、ｖｅｒｏ细胞、ＭＤＢＫ细胞和蚊细胞上增殖，并产生细胞病变和形成空斑，故可用来繁殖和滴定病毒。日本乙型脑炎的诊断方法包括临床综合诊断，病原学诊断和血清学试验。进行病毒分离与鉴定时，要求所有样品处理应于可保证生物安全的相应级别实验室内进行操作；处理样品使用过的容器、物品、实验材料均应经有效消毒处理后方可运离实验室。４ 诊断技术４．１ 临床综合诊断日本乙型脑炎在亚热带和温带地区有明显的季节性，流行集中于夏末秋初，呈散发性发生，多发生于幼龄动物，马有明显的脑炎症状，表现沉郁、兴奋、麻痹或沉郁与兴奋交替出现。怀孕母猪发生流产，公猪发生睾丸炎，取死后动物的大脑皮质、丘脑和海马角进行组织学检查，发现非化脓性脑炎变化等，可作为初步诊断依据。１犛犖／犜２４７２—２０１０４．２ 病毒分离与鉴定４．２．１ 材料４．２．１．１ 器材细胞培养瓶（或培养板）、吸管、ＣＯ２培养箱、冷冻高速离心机、研磨器、倒置显微镜、Ｇ６玻璃滤器、孔径０．２２μｍ微孔滤膜。４．２．１．２ 试剂４．２．１．２．１ 水：符合ＧＢ／Ｔ６６８２所规定的一级水。４．２．１．２．２ 细胞生长液：含１％双抗溶液（终浓度１００ＩＵ／ｍＬ青霉素和１００μｇ／ｍＬ链霉素）、１０％小牛血清、０．０３％谷氨酰胺ＭＥＭ，用７．５％碳酸氢钠（ＮａＨＣＯ３）调节ｐＨ值至７．０～７．２。４．２．１．２．３ 细胞维持液：含１％双抗溶液（终浓度１００ＩＵ／ｍＬ青霉素和１００μｇ／ｍＬ链霉素）、２％小牛血清、０．０３％谷氨酰胺ＭＥＭ，用７．５％碳酸氢钠（ＮａＨＣＯ３）调节ｐＨ值至７．０～７．２。４．２．１．２．４ ０．２５％胰酶消化液（见附录Ａ）。４．２．１．２．５ 双抗液（见附录Ａ）。４．２．１．３ 实验动物乳鼠、６ｇ～８ｇ小鼠或鸡胚。４．２．１．４ 细胞绿猴肾细胞（Ｖｅｒｏ细胞）、仓鼠肾细胞（ＢＨＫ２１）或白纹伊蚊Ｃ６／３６传代细胞等。４．２．２ 病毒分离培养４．２．２．１ 样品采集和运送４．２．２．１．１ 样品采集在流行和发病早期，无菌采集发病动物血液或脑脊髓液；在动物死亡后，无菌采取大脑组织；流产母猪采取流产死胎脑组织。４．２．２．１．２ 运送及保存条件能立即进行实验室检测的样品，保存于４℃或置于冷藏盒中快速送达，不能立即检测的样品置于－７０℃冷冻保存待检。４．２．２．２ 样品制备血液样品应分离出血清或血浆；脑脊髓液可直接应用。脑组织研磨匀浆，加入无血清细胞培养液，制成１０％悬液，３０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，吸取上清液，加入１％双抗溶液，４℃作用３ｈ～４ｈ（确定无污染者可不加双抗溶液处理）后备用。污染较为严重的样品或可疑受污染的样品，应用０．２２μｍ的微孔滤膜进行过滤处理。４．２．２．３ 病毒分离方法４．２．２．３．１ 实验动物分离法取１日龄～４日龄乳鼠或６ｇ～８ｇ小鼠１０只，用左手固定，在耳与眼之间用３％碘酒消毒，７５％酒精脱碘，右手持微量注射器在耳与眼之间消毒部位刺入硬脑膜下。乳鼠接种样品０．０２ｍＬ，６ｇ～８ｇ小鼠接种０．０５ｍＬ。然后用左手拇指及食指抓住小鼠顶部皮肤，将其尾部夹在左手掌与小手指之间，翻转使小鼠腹部朝上，消毒腹部，右手持注射器向腹腔内注入样品０．２ｍＬ～０．３ｍＬ。对照组小鼠按上述操作程序在同样部位接种同剂量的无血清细胞培养液。小鼠接种后逐日观察，约１４ｄ，如果对照小鼠正常，而接种样品的小鼠表现松毛，弓背怕冷，发抖震颤，圆圈运动，躯体麻痹，活动无力，或出现死亡，立即对发病或死亡小鼠剖检采取脑组织，按４．２．２．２的方法制成接种样品，再按上述接种方法接种小鼠，连续传两代后，小鼠仍出现发病死亡，排除细菌感染所致，作病毒鉴定。４．２．２．３．２ 细胞培养法将制备好的样品接种于２４孔细胞培养板培养的传代细胞单层，每份样本至少接种４孔，每孔２犛犖／犜２４７２—２０１００．１ｍＬ～０．２ｍＬ，３７℃吸附１ｈ，倾去多余液体并用无血清培养基洗一次，加入１ｍＬ细胞生长液，放入３７℃的ＣＯ２恒温培养箱中培养５ｄ～７ｄ。设正常细胞对照至少４孔。样品接种２４ｈ后于倒置显微镜下逐日观察细胞病变，并作好相应记录，若细胞对照孔正常，而接种样品孔出现细胞萎缩、脱落、形成空斑、核聚成团等细胞病变现象时，立即转入新长满单层的细胞培养板，如果观察仍出现类似细胞病变，且日渐明显，则可收获细胞培养物，放入－７０℃冰箱中待鉴定。如果对照细胞与接种样品细胞均无变化，应盲传两代。盲传过程中若出现细胞病变，按上述原则，收获细胞培养物，放入－７０℃冰箱中待鉴定；若盲传３代未出现细胞病变，则按未分离到日本乙型脑炎病毒出具结果。４．２．３ 病毒鉴定４．２．３．１ 初步鉴定将上述分离方法（４．２．２．３）中获得的乳鼠脑组织或细胞培养物用ＲＴＰＣＲ、血凝抑制试验和补体结合试验等方法任选一种作出初步鉴定。４．２．３．２ 最终鉴定４．２．３．２．１ 采用小鼠中和试验（固定血清稀释病毒法）做最终鉴定。４．２．３．２．２ 将标准阳性血清和阴性血清５６℃３０ｍｉｎ灭活。４．２．３．２．３ 将参考病毒和待检定病毒分别作１０倍连续稀释，一般稀释８个滴度，分别与等量的阳性血清、阴性血清混合，在３７℃感作１ｈ。４．２．３．２．４ 用３周龄小鼠进行脑内接种，每只小鼠接种０．０３ｍＬ，每一个病毒稀释度接种６只，连续观察２周。４．２．３．２．５ 记录各稀释度小鼠的死亡数和存活数，按ＲｅｅｄＭｕｅｎｃｈ法计算半数致死量（ＬＤ５０）。４．２．３．２．６ 结果判定ＮＩ１（阳性血清中和参考病毒的中和指数）＝ｌｇ病毒对照组ＬＤ５０（参考病毒中和阴性血清）－ｌｇ阳性血清对照组ＬＤ５０（参考病毒中和阳性血清）。ＮＩ２（阳性血清中和被检病毒的中和指数）＝ｌｇ病毒对照组ＬＤ５０（参考病毒中和阴性血清）－ｌｇ待检病毒组ＬＤ５０（待检病毒中和阳性血清）。当｜ＮＩ１－ＮＩ２｜≤０．５时，即可确定分离病毒为日本乙型脑炎病毒。４．３ 犚犜犘犆犚检测病原核酸４．３．１ 试剂与材料４．３．１．１ 参考毒株：Ｎａｋａｙａｍａ或ＪａＧＡｒ０１株，由指定单位提供。４．３．１．２ 犜犪狇酶：保存于－２０℃，随用随取。４．３．１．３ ｄＮＴＰ：含ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ各２．５ｍｍｏｌ／Ｌ。４．３．１．４ 逆转录酶ＭＭＬＶ：避免反复冻融或温度剧烈变化。４．３．１．５ ＲＮＡ酶抑制剂（ＲＮａｓｉｎ）：避免反复冻融或温度剧烈变化。４．３．１．６ 引物：本试验选用保守性和特异性均好的ＮＳ１区序列作为ＰＣＲ扩增区，设计三条引物Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３，采用半套式ＰＣＲ方法。引物位置和序列如下：Ｐ１（２４８７～２５０６） ＧＴＧＣＣＡＴＴＧＡＣＡＴＣＡＣＡＡＧＰ２（２６７７～２６９７） ＴＣＴＧＧＧＡＡＣＣＣＧＴＡＣＧＧＧＡＣＰ３（２８７７～２８９６） ＴＧＴＣＴＣＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴＡＣＧＰ１、Ｐ３引物扩增片段为４０９ｂｐ，Ｐ２、Ｐ３引物扩增片段为２１９ｂｐ。４．３．２ 其他试剂无水乙醇、异丙醇和三氯甲烷等均为市售分析纯。３犛犖／犜２４７２—２０１０４．３．３ 器材和设备ＰＣＲ扩增仪、电泳仪、微量移液器用吸头、凝胶成像分析仪、恒温培养箱、普通冰箱、低温冰箱、组织匀浆器或研磨器、ＤＥＰＣ处理的灭菌离心管和离心机等。４．３．４ 操作方法４．３．４．１ 样品采集与处理４．３．４．１．１ 样品采集疑似动物样品主要采集血液和脑脊液，保存于４℃或置于冷藏盒中；死亡动物无菌采集大脑组织；无症状动物应采集抗凝全血；胎儿采集脑组织；收获细胞培养物。４．３．４．１．２ 样品处理固体组织样品需用０．０１ｍｏｌ／ＬｐＨ７．２的ＰＢＳ配制成２０％（质量浓度）悬液，匀浆或研磨，备用。全血、脑脊液、细胞培养物等液状样品直接用于检测。４．３．４．２ 对照样品制备４．３．４．２．１ 阳性样品将日本乙型脑炎病毒接种于长满单层的ＢＨＫ２１细胞（或Ｖｅｒｏ、Ｃ６／３６等），３７℃吸附１ｈ后加入维持液，置５％ＣＯ２培养箱中３７℃培养，逐日观察，待细胞病变（ＣＰＥ）达约７５％时收获病毒悬液，小瓶分装，每瓶１ｍＬ，置－７０℃保存备用。４．３．４．２．２ 阴性样品采用４．３．４．２．１同样方法制备的不接种病毒的细胞培养物。４．３．４．３ 样品总犚犖犃提取４．３．４．３．１ 取１．５ｍＬ灭菌无ＲＮＡ酶污染的离心管若干支，并作编号标识。分别加入相应编号被检样品和阳性、阴性对照样品各２５０μＬ，再加入７５０μＬＴｒｉｚｏｌ，旋涡振荡混匀。４．３．４．３．２ 瞬时离心，小心打开管盖，加入２００μＬ三氯甲烷，旋涡振荡混匀，静置５