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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２４５３—２０１０进出口动物源性食品中二硝托胺残留量的测定 液相色谱质谱／质谱法犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狕狅犪犾犲狀犲狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀犳狅狅犱狊狋狌犳犳狊狅犳犪狀犻犿犪犾狅狉犻犵犻狀犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋—犔犆犕犛／犕犛犿犲狋犺狅犱２０１００１１０发布２０１００７１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准进出口动物源性食品中二硝托胺残留量的测定 液相色谱质谱／质谱法ＳＮ／Ｔ２４５３—２０１０中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６ ６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６ 印张１．２５ 字数３０千字２０１０年５月第一版 ２０１０年５月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２０７４６ 定价２１．００元书书书前 言 本标准的附录Ａ、附录Ｂ和附录Ｃ均为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准由中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局负责起草。本标准主要起草人：刘永、吴岩、杨长志、康庆贺、王雪飞、鞠文东。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２４５３—２０１０进出口动物源性食品中二硝托胺残留量的测定 液相色谱质谱／质谱法１ 范围本标准规定了动物源性食品中二硝托胺的制样和液相色谱质谱／质谱检测及确证方法。本标准适用于动物肉、肝脏、肾脏、牛奶中二硝托胺残留量的测定。２ 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方面研究使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法３ 方法提要用乙腈提取试样中的二硝托胺，提取液经中性氧化铝固相萃取柱净化，洗脱液浓缩后定容，液相色谱质谱／质谱仪测定，外标法定量。４ 试剂和材料所有试剂除特殊注明外，所用试剂均为分析纯，水为ＧＢ／Ｔ６６８２规定的一级水。４．１ 乙腈：色谱纯。４．２ 二氯甲烷。４．３ 甲醇。４．４ 丙酮。４．５ 氯化钠。４．６ 无水硫酸钠：经６５０℃灼烧４ｈ，冷却后在干燥器中储存备用。４．７ 无水硫酸钠柱：用内径约为１．５ｃｍ的下部收口玻璃管，收口处填装少量玻璃棉，然后填装无水硫酸钠，高度约为１．５ｃｍ左右。４．８ 二氯甲烷丙酮（７＋３）溶液：量取１００ｍＬ丙酮，用４００ｍＬ二氯甲烷稀释。４．９ 甲醇丙酮（８＋２）溶液：量取１００ｍＬ甲醇，用４００ｍＬ丙酮稀释。４．１０ 乙腈水（４＋６）溶液：量取４００ｍＬ乙腈，用水稀释至１０００ｍＬ，过０．２２μｍ微孔滤膜。４．１１ 乙腈饱和的正己烷溶液：２０ｍＬ乙腈中加入１００ｍＬ正己烷，充分振荡后，静置分层，取上层正己烷层备用。４．１２ 中性氧化铝固相萃取柱：１０００ｍｇ，６ｍＬ，或相当者。使用前分别用１０ｍＬ丙酮、１０ｍＬ二氯甲烷丙酮（７＋３）溶液预处理，并保持柱体湿润。注：中性氧化铝固相萃取柱开封后应保持干燥。４．１３ 标准物质：二硝托胺纯度大于９８．０％，Ｃ８Ｈ７Ｎ３Ｏ５，ＣＡＳ：１４８０１６。４．１４ 标准储备溶液：准确称取按其纯度折算为１００％质量的二硝托胺标准品０．０１０ｇ，用乙腈溶解并定容至１００ｍＬ，浓度相当于１００μｇ／ｍＬ。储备液在０℃～４℃冰箱避光保存，可使用６个月。４．１５ 标准中间溶液：准确量取标准储备溶液１．０ｍＬ，用乙腈水（４＋６）溶液溶解并定容至１００ｍＬ，浓１犛犖／犜２４５３—２０１０度相当于１．０μｇ／ｍＬ，在０℃～４℃冰箱避光保存，可使用１周。４．１６ 标准工作溶液：根据需要用１．０ｍＬ适当浓度的标准工作溶液溶解空白样品浓缩残渣，配制成适当浓度的标准工作溶液，标准工作溶液应当天配制。５ 仪器和设备５．１ 高效液相色谱质谱／质谱仪：配电喷雾离子源（ＥＳＩ）或相当者。５．２ 天平：感量０．０１ｇ。５．３ 分析天平：感量０．１ｍｇ。５．４ 固相萃取装置。５．５ 氮吹仪。５．６ 旋涡混匀器。５．７ 均质器。５．８ 离心机。５．９ ０．２２μｍ微孔滤膜。６ 试样的制备与保存固态样品取有代表性的约２００ｇ，均分成两份作为试样，分别装入洁净容器，密封并做好标识，于－１８℃冰箱内保存；液态样品取有代表性的约２００ｍＬ，均分成两份作为试样，分别装入洁净容器，密封并做好标识，于０℃～４℃冰箱内保存。在抽样和制样操作过程中，应防止样品受到污染或发生二硝托胺含量的变化。７ 测定步骤７．１ 提取７．１．１ 固态高含量样品准确称取０．５ｇ试样（精确到０．０１ｇ）于５０ｍＬ离心管中，加入２ｇ无水硫酸钠、２０ｍＬ乙腈，用均质器以１００００ｒ／ｍｉｎ均质１ｍｉｎ，以４０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，上清液转移至５０ｍＬ具塞离心管中，样品用１０ｍＬ乙腈重复上述提取、离心操作，合并两次提取的上清液，加入经乙腈饱和的正己烷溶液１０ｍＬ，用旋涡振荡器混匀２ｍｉｎ后，以４０００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ，弃去上清液，下层过无水硫酸钠柱，转移至鸡心瓶，浓缩近干后待净化。７．１．２ 固态低含量样品准确称取５．０ｇ试样（精确到０．０１ｇ）于５０ｍＬ离心管中，以下同７．１．１。７．１．３ 液态样品准确量取５．０ｍＬ试样于５０ｍＬ离心管中，加入２ｇ氯化钠、１０ｍＬ乙腈，旋涡振荡３ｍｉｎ，以４０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取上清液５ｍＬ于１５ｍＬ离心管中，加入经乙腈饱和的正己烷溶液１０ｍＬ，用旋涡振荡器混匀２ｍｉｎ后，以４０００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ，弃去上清液，下层用氮吹仪浓缩至近干，待净化。７．２ 净化残渣用２．０ｍＬ二氯甲烷丙酮（８＋２）溶液溶解，以１ｍＬ／ｍｉｎ～２ｍＬ／ｍｉｎ的速度过中性氧化铝固相萃取柱，再用２．０ｍＬ二氯甲烷丙酮（７＋３）溶液分两次洗涤浓缩瓶，过中性氧化铝固相萃取柱，弃去流出液，待上样液流出后，用１０ｍＬ甲醇丙酮（８＋２）溶液洗脱，洗脱液于氮吹仪浓缩至近干，用１．０ｍＬ乙腈水（４＋６）溶液溶解残渣，经０．２２μｍ滤膜过滤，供液相色谱质谱／质谱测定。７．３ 测定７．３．１ 液相色谱条件ａ） 色谱柱：Ｃ１８１．７μｍ，２．１（内径）×５０ｍｍ，或相当者；２犛犖／犜２４５３—２０１０ｂ） 流动相：乙腈∶水＝４∶６；ｃ） 流速：０．２５ｍＬ／ｍｉｎ或根据仪器条件优化；ｄ） 柱温：３０℃；ｅ） 进样量：５μＬ。７．３．２ 质谱条件ａ） 离子源：电喷雾离子源；ｂ） 扫描方式：负离子；ｃ） 检测方式：多反应监测（ＭＲＭ）；ｄ） 其他质谱／质谱参考条件参见附录Ａ中表Ａ．１。７．３．３ 液相色谱质谱／质谱测定７．３．３．１ 定量测定根据样液中二硝托胺的浓度大小，选定峰高相近的标准工作溶液，标准工作溶液和样液中二硝托胺的响应值均应在仪器的检测线性范围内。对标准工作溶液和样液等体积参差进样测定，在上述色谱条件下，二硝托胺的参考保留时间约为０．８６ｍｉｎ，标准溶液的多反应监测色谱图参见附录Ｂ中图Ｂ．１。７．３．３．２ 定性测定在相同的试验条件下，样品与标准工作液中待测物质的质量色谱峰相对保留时间在２．５％以内，并且在扣除背景后的样品质量色谱图中，所选择的离子对均出现，同时与标准品的相对丰度允许偏差不超过表１规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。表１ 使用定性液相色谱质谱／质谱时相对离子丰度最大允许偏差相对离子丰度（犓）犓＞５０２０＜犓＜５０１０＜犓＜２０犓≤１０允许的最大偏差／％±２０±２５±３０±５０８ 空白试验除不加试样外，均按上述操作步骤进行。９ 结果计算和表述用数据处理软件中的外标法，或绘制标准曲线，按照式（１）计算样品中二硝托胺的含量。犡＝犮·犞犿·１０００……………………………（１） 式中：犡———试样中待测组分含量，单位为毫克每千克（μｇ／ｋｇ）；犮———由标准曲线而得的样液中待测组分的浓度，单位为纳克每毫升（ｎｇ／ｍＬ）；犞———样液最终定容体积，单位为毫升（ｍＬ）；犿———最终样液所代表的试样质量，单位为克（ｇ）。１０ 测定低限、回收率１０．１ 测定低限本方法二硝托胺测定低限为５μｇ／ｋｇ。１０．２ 回收率回收率试验数据参见附录Ｃ中表Ｃ．１。３犛犖／犜２４５３—２０１０附 录 犃（资料性附录）串联质谱条件１） 串联质谱条件：ａ） 电离方式：ＥＳＩ；ｂ） 毛细管电压：３．０ｋＶ；ｃ） 源温度：１１０℃；ｄ） 去溶剂温度：３５０℃；ｅ） 锥孔气流：５０Ｌ／ｈ；ｆ） 去溶剂气流：５５０Ｌ／ｈ；ｇ） 碰撞气：氩气，碰撞气压０．３３Ｐａ（３．３０×１０－３ｍｂａｒ）；ｈ） 监测模式：多反应监测，多反应监测条件见表Ａ．１。表犃．１ 多反应监测条件化合物母离子子离子驻留时间／ｓ锥孔电压／Ｖ碰撞能量／ｅＶ二硝托胺２２４．３１８１．２ａ０．１２０１０１５１．２０．１２０１８ａ离子用于定量。１） 非商业性声明：表Ａ．１所列参数是在ＷａｔｅｒｓＱｕａｔｔｒｏＰｒｅｍｉｅｒ质谱仪上完成的，此处列出试验用仪器型号仅是为了提供参考，并不涉及商业目的，鼓励标准使用者尝试采用不同厂家或型号的仪器。４犛犖／犜２４５３—２０１０附 录 犅（资料性附录）标准样品色谱图 二硝托胺高效液相色谱质谱／质谱色谱图，见图Ｂ．１。ａ）ｂ）ｃ）图犅．１ 二硝托胺高效液相色谱质谱／质谱色谱图５犛犖／犜２４５３—２０１０附 录 犆（资料性附录）添加回收率 添加回收率见表Ｃ．１。表犆．１ 添加回收率（狀＝１０）食品名称添加浓度／（ｍｇ／ｋｇ或ｍｇ／Ｌ）平均测定值／（ｍｇ／ｋｇ）平均回收率／％相对标准偏差／％鸡肉０．１１．０６．００．０８７０．８９４５．６６３８７．２８３．８９４．４１０．５４８．６２４．５０鸡肝０．１１．０６．００．０８８０．８２０５．３２８５．６８１．９９８８．６２９．０８７．４８４．８３鸡肾０．１１．０６．００．０８８０．８５９５．３１８８．５８５．８８８８．６０７．４５１０．７９５．４３牛奶０．１１．０６．００．０８７０．９２６５．３９４８７．０９２．６８９．９７．４３５．５６６．１０６犛犖／犜２４５３—２０１０犉狅狉犲狑狅狉犱犃狀狀犲狓犃，犪狀狀犲狓犅犪狀犱犪狀狀犲狓犆狅犳狋犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱犻狊犻狀犳狅狉犿犪狋犻狏犲犪狀狀犲狓犲狊．犜犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱狑犪狊狆狉狅狆狅狊犲犱犫狔犪狀犱犻狊狌狀犱犲狉狋犺犲犮犺犪狉犵犲狅犳犆犺犻狀犪犖犪狋犻狅狀犪犾犚犲犵狌犾犪狋狅狉狔犆狅犿犿犻狊狊犻狅狀犳狅狉犆犲狉狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀犪狀犱犃犮犮狉犲犱犻狋犪狋犻狅狀．犜犺犲狊狋犪狀犱犪狉犱狑犪狊犱狉犪犳狋犲犱犫狔犎犲犻犾狅狀犵犼犻犪狀犵犈狀狋狉狔犈狓犻狋犐狀狊狆犲犮狋犻狅狀犪狀犱犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲犅狌狉犲犪狌狅犳狋犺犲犘犲狅狆犾犲’狊犚犲狆狌犫犾犻犮狅犳犆犺犻狀犪．犜犺犲犿犪犻狀犱狉犪犳狋犲狉狊狅犳狋犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱犪狉犲犔犻狌犢狅狀犵犲狋犪犾．犜犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱犻狊犪狆狉狅犳犲狊狊犻狅狀犪犾狊狋犪狀犱犪狉犱犳狅狉犲狀狋狉狔犲狓犻狋犻狀狊狆犲犮狋犻狅狀犪狀犱狇狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅犿狌犾犵犪狋犲犱犳狅狉狋犺犲犳犻狉狊狋狋犻犿犲．７犛犖／犜２４５３—２０１０犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狕狅犪犾犲狀犲狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀犳狅狅犱狊狋狌犳犳狊狅犳犪狀犻犿犪犾狅狉犻犵犻狀犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋—犔犆犕犛／犕犛犿犲狋犺狅犱１ 犛犮狅狆犲犜犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱狊狆犲犮犻犳犻犲狊狋犺犲犿犲狋犺狅犱狊狅犳狊犪犿狆犾犲狆狉犲狆犪狉犪狋犻狅狀犪狀犱犱犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀犫狔犾犻狇狌犻犱犮犺狉狅犿犪狋狅犵狉犪狆犺狔犿犪狊狊狊狆犲犮狋狉狅犿犲狋狉狔狅犳狕狅犪犾犲狀犲狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀犳狅狅犱狊狋狌犳犳狊狅犳犪狀犻犿犪犾狅狉犻犵犻狀．犜犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱犻狊犪狆狆犾犻犮犪犫犾犲狋狅