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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准!!#!#!!!!$%$苹果皱果类病毒检疫鉴定方法$%&%’&()*+*,(,%*&(-(’+&()*)-+../%-01(&’0(*2/%3(0)(,!$%$4%%4$%发布!$%%4$&4$%实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前!!言!!!!#$%&$标准分为两个部分###苹果茎沟病毒检疫鉴定方法$###苹果皱果类病毒检疫鉴定方法%本部分为!!#$%&$的第$部分%本部分按照’(!#)*)#$++,给出的规则起草%本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口%本部分起草单位中国检验检疫科学研究院%本部分主要起草人李桂芬&魏梅生&张永江&马洁&相宁&李明福%!!!#!#!*!!$%$苹果皱果类病毒检疫鉴定方法%!范围!!#$%&$的本部分规定了苹果皱果类病毒检疫鉴定方法%本部分适用于带有苹果皱果类病毒的进境种苗或其他繁殖材料的检疫和鉴定%!!原理苹果皱果类病毒学名-../01234562478/0942:4;’缩写-=;%苹果皱果类病毒的特性是本标准制定的主要依据$该类病毒的分类地位&寄主范围&病害症状&地理分布&传播途径&基因组特征等参见附录-%!仪器&用具和试剂*%!仪器*%*%!?=@扩增仪%*%*!!电泳仪&电泳槽%*%*!水浴锅%*%*#!高速冷冻离心机%*%*&!凝胶成像系统%*%*’!振荡器%*%*(!冰箱%*%*)!电子分析天平(+*++)A)%*!!用具*!*%!可调移液器(+*)B#$B’)B#)+B’)+B#)++B’)++B#)+++B)%*!*!!可调移液器吸头%*!*!离心管%*!*#!研钵%*!试剂**%!$%抽提缓冲液$+CC:/!B!#24DEF=/’.FG*+)+CC:/!B!乙二胺四乙酸二钠(=)+F)&$HGI$*$F$H)+*GC:/!B!氯化钠(I=/))J十二烷基磺酸钠(!K!)+*LJ二乙基二硫代氨基甲酸钠(KMN=-)$J聚乙烯吡咯烷酮(??’O$&+++E&++++)+*LJ巯基乙醇)!!#!#!*!!$%$**!!%$*#&’G,+CC:/!B!!#24DG,+C:/!B硼酸$+CC:/!B乙二胺四乙酸二钠(=)+F)&$HGI$*$F$H)调.F至G*%’加双蒸水定容至)B%**!加样缓冲液$P#(NQ+J!!甘油+*+QJ溴酚蓝+*+QJ二甲苯蓝**#!固定液G,J水,*LJ乙醇)J冰乙酸**&!染色液)A硝酸银加双蒸水定容至L++CB%**’!显色液+*&C:/!B!!氢氧化钠&CB甲醛用双蒸水定容至)B%**(!&$*#%’#24D!!!!!!!!!!!!!!!!!$&$*+A乙二胺四乙酸二钠(NK#-*I$*$F$H)%R*$A冰乙酸LR*)CB用双蒸水定容至)B%#!检疫鉴定方法#*%!往返聚丙烯酰胺凝胶电泳(()*+(,-.%/’)#*%*%!$%的提取#*%*%*%!取样苹果苗木取枝皮部分’啤酒花取花或叶片%#*%*%*!!称取苹果枝皮&啤酒花的花或叶片样品(被检测样品&阳性样品###带有苹果皱果类病毒的植物材料&阴性样品###不带有苹果皱果类病毒的材料)$A’液氮充分研磨成细粉末%加入$倍体积的@-抽提缓冲液’再加入$倍体积的水饱和苯酚’室温振荡混合%+C47’)++++2!C47离心’)+C47%#*%*%*!取上清液’加等体积的苯酚E三氯甲烷()S))抽提一次’)++++2!C47离心)+C47%#*%*%*#!取上清液’加入)!)+体积的%C:/!B的乙酸钠’$*L倍体积乙醇%TG+U’%+C47以上(或$!!#!#!*!!$%$T$+U过夜)%#*%*%*&!)%+++2!C47离心)LC47%#*%*%*’!沉淀经RLJ冷乙醇洗涤’真空干燥后溶于双蒸水中%#*%*!!聚丙烯酰胺凝胶电泳#*%*!*%!凝胶制备聚丙烯酰胺凝胶浓度为QJ%在小烧杯中按顺序加入双蒸水$+*RRCB’%+J凝胶储备液QCB’)+P#(N缓冲液%CB’#NONK%+B’)+J过硫酸铵(现配现用)$++B%充分混匀后灌胶%然后插入样品梳%待胶完全凝聚后在电泳槽内加入)P#(N电级缓冲液’然后轻轻拔掉梳子%#*%*!*!!预电泳加样前进行预电泳’电压)L+’)+C47%#*%*!*!加样取)+B提取的@-样品(被检测样品&阳性样品&阴性样品)’按)S)的比例加入加样缓冲液%#*%*!*#!第一向电泳电极缓冲液为#(N’电压)L+%当溴酚蓝移出凝胶板’二甲苯蓝接近胶底部时’停止电泳%#*%*!*&!第二向电泳弃去第一向电泳的电极缓冲液’先将)P#(N缓冲液加热到G+U’倒在电泳槽内’保持温度R+U#RLU’)LC47’使核酸完全变性’调转电极方向’电压为$++’至二甲苯蓝示踪染料带迁移到胶顶部’停止电泳%#*%*!*’!固定将胶先用双蒸水冲洗%次’每次$C47#%C47’然后用固定液固定Q+C47%#*%*!*(!染色弃去固定液’用双蒸水冲洗%次’每次$C47#%C47’然后加入染色液振荡染色%+C47%#*%*!*)!显色弃去染色液’用双蒸水冲洗%次’每次$C47#%C47’将胶转移至显色液中’振荡’直至显出淡褐色条带’弃去显色液’加入+*RLC:/!B的碳酸钠溶液%#*!!$#-.0$检测#*!*%!$%的抽提同&*)*)%#*!*!!引物的合成根据已报道的苹果皱果类病毒的序列设计@#E?=@特异性引物’上游引物)#$+’L+E#’’’=#==--=#-’#’’##=E%+’下游引物%L)#%Q,’L+E=-===---=--’’’--#==#E%+’扩增片断大小为%Q,V.%%!!#!#!*!!$%$#*!*!12%的合成待检测核酸%B’下游引物($+C:/!B)+*LB’KN?=水%*+B’;#?()+CC:/!B)+*LB’@-D47(&+W!B)+*LB’LPOEOB反转录酶缓冲液$*+B’OEOB反转录酶($++W!B)+*LB’混匀’&$U水浴)X’合成6K-%#*!*#!.0$扩增;#?()+CC:/!B))B’上游引物($+C:/!B)+*LB’下游引物($+C:/!B)+*LB’)+P?=@缓冲液$*LB’6K-模板$*+B’双蒸水)G*+B’!#酶($W!B)+*LB’,&U!LC47%进行如下循环,&U!%+D’LGU!%+D’R$U!%+D$%+个循环’R$U!)+C47%#*!*&!琼脂糖凝胶检测#*!*&*%!制备凝胶将)P#-N和电泳级琼脂糖按)*+J配好’在水浴中融化混匀’冷却至LLU左右%#*!*&*!!加溴化乙锭溴化乙锭浓度为+*LA!CB’与制备的凝胶混匀’倒入凝胶槽中’插上样品梳’待琼脂糖凝固’取出梳子%#*!*&*!加样将加样缓冲液与样品混合后加入样品孔’并加入分子量标准物%#*!*&*#!电泳接通电源’根据凝胶的厚度’缓冲液浓度等设置使用的电压’电泳%+C47%#*!*&*&!结果观察电泳结束后用凝胶成像系统记录结果%&!检疫鉴定结果判断样品经往返聚丙烯酰胺凝胶电泳实验结果有条带$@#E?=@电泳结果为阳性对照和待测样品都出现%Q,V.特异性条带’而阴性对照没有该条带’可判断待检测样品为带有苹果皱果类病毒%’!样品保存如果发现苹果皱果类病毒阳性样品’样品保存)年%苹果无性繁殖材料中发现类病毒的’采集枝皮直接放TG+U冰箱保存或干燥后放TG+U保存%啤酒花中发现类病毒的’采花或叶片直接放TG+U冰箱保存或干燥后放TG+U保存%检测原始记录&照片等文档按有关规定做好登记&标记和存档’以便必要时复核%&!!#!#!*!!$%$附!录!%(资料性附录)苹果皱果类病毒的背景资料%*%!分类地位未明确分类地位的类病毒%%*!!寄主范围自然侵染苹果($%&’(&)*%)&啤酒花(+&)&%&’%&(&%&’)%%*!病害症状典型的症状是果实表面粗糙不平和皱缩%新鲜的苹果果实中形成褐色坏死髓%有的品种被侵染果实趋向于过早成熟而落果%有的品种分枝上出现水泡状茎和嫩枝掉皮%%*#!地理分布日本%%*&!传播途径容易通过芽接’嫁接和嵌木芽接方式传播’实验证明也能通过刀削方式传播%%*’!基因组单链环状@-’全序列%R+75%L!!#!#!*!!$%$