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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２２０６．７—２０１０化妆品微生物检测方法第７部分：蛋白免疫印迹法检测疯牛病病原犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犿犻犮狉狅犫犻狅犾狅犵犻犮犪犾犻狀犮狅狊犿犲狋犻犮狊—犘犪狉狋７：犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犫狅狏犻狀犲狊狆狅狀犵犻犳狅狉犿犲狀犮犲狆犺犪犾狅狆犪狋犺狔（犅犛犈）犫狔狑犲狊狋犲狉狀犫犾狅狋犿犲狋犺狅犱２０１００３０２发布２０１００９１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 ＳＮ／Ｔ２２０６《化妆品微生物检测方法》系列标准共分为７部分：———第１部分：沙门氏菌；———第２部分：需氧芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌；———第３部分：肺炎克雷伯氏菌；———第４部分：链球菌；———第５部分：肠球菌；———第６部分：破伤风梭菌；———第７部分：蛋白免疫印迹法检测疯牛病病原。本部分为ＳＮ／Ｔ２２０６的第７部分。本部分附录Ａ为规范性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本部分主要起草人：马贵平、史喜菊、李炎鑫、刘全国、李冰玲、刘旭辉。本部分系首次发布的检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２２０６．７—２０１０化妆品微生物检测方法第７部分：蛋白免疫印迹法检测疯牛病病原１ 范围ＳＮ／Ｔ２２０６的本部分规定了进出口化妆品中疯牛病病原检测———蛋白免疫印迹法。本部分适用于化妆品中疯牛病病原的检测。２ 规范性引用文件下列文件中的条款通过ＳＮ／Ｔ２２０６的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验用水规格和试验方法ＧＢ１９４８９ 实验室 生物安全通用要求化妆品卫生规范（卫生部）３ 缩略语下列缩略语适用于ＳＮ／Ｔ２２０６的本部分。３．１狑犲狊狋犲狉狀犫犾狅狋蛋白免疫印迹。３．２犘狉犘朊蛋白。３．３犘狉犘犮细胞型朊蛋白。３．４犘狉犘狊犮致病性朊蛋白。３．５犘犓蛋白酶Ｋ。３．６犘犕犛犉苯甲基磺酰氟。３．７狋狉犻狊犫犪狊犲三（羟甲基）氨基甲烷。１犛犖／犜２２０６．７—２０１０３．８犛犇犛十二烷基硫酸钠。３．９犛犇犛犘犃犌犈十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。３．１０犘犞犇犉聚偏二氟乙烯。３．１１犘犅犛磷酸盐缓冲盐水。３．１２犈犆犔电化学发光。４ 主要仪器设备４．１ 生物安全柜（２ＢⅡ型）。４．２ 台式高速离心机（最高离心力可达１２０００犵以上）。４．３ 组织匀浆机。４．４ 垂直电泳系统（含转印装置）。４．５ 水浴锅（温度可达到１００℃±１℃）。４．６ 恒温培养箱（３７℃±０．５℃）。４．７ Ｘ光片洗片机。４．８ 磁力搅拌器和搅拌子（可以加热）。４．９ 微量可调移液器（２μＬ、１０μＬ、１００μＬ、１０００μＬ）和相应吸头。４．１０ 各种冰箱（精度分别达到４℃±３℃、－２０℃±５℃和－７０℃±１０℃）。４．１１ 高压灭菌锅（温度可达到１３５℃）。４．１２ ＰＶＤＦ转印膜（０．４５μｍ）。５ 方法原理疯牛病的病原是宿主细胞编码的一种正常蛋白质的异构体，这种正常蛋白简称为ＰｒＰｃ，其异构体简称为ＰｒＰｓｃ。正常的ＰｒＰｃ对蛋白酶Ｋ敏感，不致病；但其异构体ＰｒＰｓｃ对蛋白酶Ｋ有抗性，可致病，称为朊病毒（ｐｒｉｏｎ）。将被检化妆品制备成可溶性溶液，分成两等份，一份用蛋白酶Ｋ消化，另一份不用蛋白酶Ｋ消化，然后进行蛋白质电泳和转印试验，在ＰＶＤＦ膜上进行抗原抗体反应。如果出现特异性条带，即可判定被检化妆品溶液中存在ＰｒＰｓｃ。６ 试剂６．１ １２％ＴｒｉｓＧｌｙｃｉｎｅ预制凝胶（或自制１２％Ｔｒｉｓ甘氨酸ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶）。６．２ ＰｒＰ单克隆抗体（鼠抗ＰｒＰＩｇＧ１，如６Ｈ４）。６．３ 辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠ＩｇＧ。２犛犖／犜２２０６．７—２０１０６．４ 裂解缓冲液（配方见附录第Ａ．１章）。６．５ ＳＤＳＰＡＧＥ上样缓冲液（配方见附录第Ａ．２章）。６．６ 电泳缓冲液（配方见附录第Ａ．３章）。６．７ 电转缓冲液（配方见附录第Ａ．４章）。６．８ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）（配方见附录第Ａ．５章）。６．９ ＰＢＳＴｗｅｅｎ２０（配方见附录第Ａ．６章）。６．１０ ＰＫ储存液（配方见附录第Ａ．７章）。６．１１ ＥＣＬ（电化学发光增强剂，配方见附录第Ａ．８章）。６．１２ ＰＭＳＦ（蛋白酶抑制剂，配方见附录第Ａ．９章）。６．１３ ＤＭＳＯ（分析级纯）。６．１４ 乙醇（分析级纯）。６．１５ 实验用水：所有试剂的配制用水应为蒸馏水或去离子水，符合ＧＢ／Ｔ６６８２的要求。７ 操作步骤７．１ 样品制备７．１．１ 被试化妆品应在使用前制备。按照卫生部《化妆品卫生规范》中有关规定，根据溶解性不同，水溶性化妆品用ＰＢＳ作溶剂，脂溶性化妆品用ＤＭＳＯ或乙醇作溶剂，制成终浓度为１０％的溶液。如果需要，可以使用涡旋混合或超声波处理或３７℃加热等来帮助溶解。７．１．２ 取上述溶液０．７ｍＬ加入到１．５ｍＬＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，再加入０．７ｍＬ裂解缓冲液，振荡混匀，２０００犵离心５ｍｉｎ。７．１．３ 将上清液转移到一个新的１．５ｍＬＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管中。７．１．４ 将上述上清液３９０μＬ加入到一个新的１．５ｍＬＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，并加入１０μＬ２ｍｇ／ｍＬＰＫ（ＰＫ终浓度为５０μｇ／ｍＬ），３７℃温箱中反应１ｈ后，再加入８μＬＰＭＳＦ（１ｍｇ／ｍＬ）终止ＰＫ反应，该样品称为样品＋ｐｋ。７．１．３中剩余的没有用ＰＫ消化的上清液称为样品－ｐｋ。７．１．５ 试验中对照为重组ＰｒＰｃ，不用进行ＰＫ处理，直接进行ＳＤＳＰＡＧＥ检测。７．２ 蛋白免疫印迹试验７．２．１ 制备ＳＤＳＰＡＧＥ样品：取被测样品－ｐｋ和样品＋ｐｋ以及阴、阳性对照品各３０μＬ，分别加入到四个１．５ｍＬＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，再分别加入等量的上样缓冲液，振荡混匀。沸水煮１０ｍｉｎ后冷却至室温，即为制备好的ＳＤＳＰＡＧＥ样品。７．２．２ ＳＤＳＰＡＧＥ电泳：除去预制凝胶的外包装，用记号笔标记上样孔的位置，撕去预制凝胶底部的凝胶封闭条，拔出梳子，将预制凝胶放入电泳槽内，按要求固定好，加入电泳缓冲液。将每个制备好的ＳＤＳＰＡＧＥ被测样品－ｐｋ和样品＋ｐｋ及阴、阳性对照品分别加入到预制凝胶的四个相邻的孔中，每个孔中加入１５μＬ。每次试验均设蛋白质分子量标准Ｍａｒｋｅｒ。将电泳槽与电泳仪的电源线连接好，在电压２００Ｖ下，电泳４５ｍｉｎ～６０ｍｉｎ（样品接近凝胶底部为止）。７．２．３ 电转（蛋白质从预制凝胶转移到ＰＶＤＦ膜）：剪切与海绵垫大小相等的两张滤纸和一张ＰＶＤＦ膜，将滤纸和海绵垫在电转缓冲液中浸透；ＰＶＤＦ膜先经甲醇浸透（２ｍｉｎ～３ｍｉｎ）后，再浸入电转缓冲液。按下述图１所示将海绵垫、滤纸、电泳后的凝胶、ＰＶＤＦ膜、滤纸、海绵垫依次放好，将转印装置一起放入电泳槽中，加入电转缓冲液，在电压２５Ｖ，电流１１０ｍＡ下电转１ｈ。需要特别注意的是，海绵垫、滤纸中不能含有气泡。３犛犖／犜２２０６．７—２０１０图１ 蛋白质从凝胶转移到犘犞犇犉膜装载示意图７．２．４ 电转完成后，将ＰＶＤＦ膜放入２０ｍＬ用ＰＢＳＴｗｅｅｎ２０配制的５％的脱脂奶粉溶液（以下简称封闭液）中，室温振荡反应１ｈ（也可４℃过夜）。７．２．５ 倒掉上述奶粉溶液，将ＰＶＤＦ膜浸入ＰｒＰ单克隆抗体溶液（用封闭液按ＰｒＰ单克隆抗体说明书稀释比例配制）中，室温振荡反应１ｈ（也可４℃过夜）。７．２．６ 倒掉ＰｒＰ单克隆抗体溶液，ＰＶＤＦ膜用ＰＢＳＴｗｅｅｎ２０洗三次，每次５ｍｉｎ。７．２．７ 将ＰＶＤＦ膜浸入辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠ＩｇＧ抗体溶液（用封闭液按辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠ＩｇＧ抗体说明书稀释比例配制）中，室温振荡反应１ｈ。７．２．８ 倒掉酶标二抗溶液，ＰＶＤＦ膜用ＰＢＳＴｗｅｅｎ２０洗三次，每次５ｍｉｎ。７．２．９ 将沥干的ＰＶＤＦ膜浸入到１２ｍＬＥＣＬ溶液中，作用１ｍｉｎ后取出，吸去多余液体，用单层透明的聚乙烯膜（ｐｏｌｙｔｈｅｎｅｗｒａｐ）（也可用食品保鲜膜替代）包裹，立即送到暗室。７．２．１０ 在暗室中，剪切与ＰＶＤＦ膜大小相仿的Ｘ光胶片，与ＰＶＤＦ膜重叠放入曝光暗盒中曝光，直到阳性对照的强信号出现和膜背景或蛋白酶Ｋ带出现４ｍｉｎ～８ｍｉｎ左右，为了观察到最佳可见信号，曝光时间可以更长或更短；也可使用化学发光检测系统进行检测。８ 结果判定如果检测样品（ＰＫ＋）在Ｘ光胶片上显示３条特异性信号带，则判为阳性；未出现特性条带则判为阴性。结果判定示意图见图２。注：图中Ｃ带为重组ＰｒＰｃ对照，Ｎ带为阴性样品，ＢＳＥ（＋＋）、ＢＳＥ（＋）分别为强阳性和弱阳性样品。图２ 结果判定示意图４犛犖／犜２２０６．７—２０１０９ 生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的实验室和实验人员检测疯牛病病原，所有培养物和废弃物应小心处置，严格按照ＧＢ１９４８９中的有关规定执行。５犛犖／犜２２０６．７—２０１０附 录 犃（规范性附录）试剂的配制犃．１ 裂解缓冲液犖十二烷基肌氨酸钠１０ｇ０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ（ｐＨ７．４） １００ｍＬ此溶液最好新鲜配制，４℃保存不超过３ｄ。犃．２ １×犛犇犛犘犃犌犈上样缓冲液ＴｒｉｓＢａｓｅ１．５１ｇＳＤＳ８．０ｇ蔗糖２０．０ｇ溴酚蓝０．１％（终浓度）加蒸馏水并调节酸碱度至终体积９５ｍＬ，ｐＨ６．８。使用前每９５μＬＳＤＳＰＡＧＥ上样缓冲液加入５μＬβ巯基乙醇。犃．３ １０×电泳缓冲液ＴｒｉｓＢａｓｅ３０．３ｇ甘氨酸１４４．０ｇＳＤＳ１０．０ｇ用蒸馏水定容至１０００ｍＬ。犃．４ １×电转缓冲液Ｔｒｉｓ１．４５ｇ甘氨酸７．２０ｇＳＤＳ０．１ｇ甲醇２００ｍＬ用蒸馏水定容至１０００ｍＬ。此溶液在４℃可保存１周。犃．５ 犘犅犛（狆犎７．４）氯化钠（ＮａＣｌ）８ｇ氯化钾（ＫＣｌ）０．２ｇ磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４）１．４４ｇ磷酸二氢钾（ＫＨ２ＰＯ４）０．２４ｇ加８００ｍＬ蒸馏水溶解，用盐酸调ｐＨ值至７．４，再加蒸馏水至１０００ｍＬ，１２１℃±２℃，２０ｍｉｎ高压蒸气灭菌后，室温保存。犃．６ 犘犅犛犜狑犲犲狀２０１００ｍＬＰＢＳ（ｐＨ７．２）加入１００μＬＴｗｅｅｎ２０６犛犖／犜２２０６．７—２０１０犃．７ 蛋白酶犓（２犿犵／犿犔）贮存液以可溶性粉剂购入的蛋白酶Ｋ应以灭菌的５０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ（ｐＨ８．０），１．５ｍｍｏｌ／Ｌ乙酸钙溶解，配制成浓度为２ｍｇ／ｍＬ的溶液，分装，在－２０℃下保存。犃．８ 犈犆犔增强化学发光免疫印迹检测试剂，包括Ａ液和Ｂ液。使用前等量混合Ａ液和Ｂ液，混合后尽快使用，每平方厘米转印膜至少需要０．１２５ｍＬ混合液。犃．９ １００犿犿狅犾／犔犘犕犛犉（蛋白酶抑制剂）０．４３５ｇＰＭＳＦ溶解在２５ｍＬ正丙醇中，混匀，４℃避光保存。犛犖／犜２２０６．７—２０１０书书书０１０２—７．６０２２犜／犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准化妆品微生物检测方法第７部分：蛋白免疫印迹法检测疯牛病病原ＳＮ／Ｔ２２０６．７—２０１０中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６ ６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６ 印张０．７５ 字数１２千字２０１０年５月第一版 ２０１０年５月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２０８４０ 定价１６．００元