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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１３７９—２０１０代替ＳＮ／Ｔ１３７９．１—２００４，ＳＮ／Ｔ１３７９．２—２００５，ＳＮ／Ｔ１３７９．３—２００６古典猪瘟检疫规程犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犮犾犪狊狊犻犮犪犾狊狑犻狀犲犳犲狏犲狉２０１０１１０１发布２０１１０５０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准代替ＳＮ／Ｔ１３７９．１—２００４《猪瘟单克隆抗体酶联免疫吸附试验》、ＳＮ／Ｔ１３７９．２—２００５《猪瘟免疫荧光技术操作规程》和ＳＮ／Ｔ１３７９．３—２００６《猪瘟中和免疫荧光试验操作规程》。本标准与ＳＮ／Ｔ１３７９．１—２００４、ＳＮ／Ｔ１３７９．２—２００５、ＳＮ／Ｔ１３７９．３—２００６相比，主要技术变化如下：———增加了荧光抗体实验；———增加了病毒分离试验；———增加了双抗体夹心ＥＬＩＳＡ实验；———修改了单克隆抗体免疫过氧化物酶实验；———修改了过氧化物酶联中和实验。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准由中华人民共和国厦门出入境检验检疫局负责起草，中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国河南出入境检验检疫局和中华人民共和国珠海出入境检验检疫局参与。本标准主要起草人：龚艳清、董志珍、许如苏、张巨州、陈信忠、徐淑菲、孔繁德、沙才华、徐海聂。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ／Ｔ１３７９．１—２００４；———ＳＮ／Ｔ１３７９．２—２００５；———ＳＮ／Ｔ１３７９．３—２００６。Ⅰ犛犖／犜１３７９—２０１０古典猪瘟检疫规程１ 范围本标准规定了古典猪瘟临床诊断、实验室检测的技术规范。本标准适用于古典猪瘟病毒和抗体的检测。２ 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法３ 缩略语下列缩略语适用于本文件。ＢＤ：边界病ＢＶＤ：牛病毒性腹泻ＣＳＦ：古典猪瘟ＣＳＦＶ：古典猪瘟病毒ＦＡＴ：荧光抗体试验ＦＡＶＮ：荧光抗体病毒中和试验ＦＩＴＣ：异硫氰酸荧光素ＨＲＰＯ：辣根过氧化物酶ＩＦＡ：免疫荧光实验ＮＰＬＡ：过氧化物酶联中和试验４ 临床诊断４．１ 流行病学ＣＳＦＶ在自然条件下只感染猪，不同年龄、性别、品种的猪和野猪都易感，一年四季均可发生。病猪、潜伏期和康复期带毒猪均能把病毒传播给易感猪。病猪是主要传染源，病猪排泄物和分泌物，病死猪及其脏器，急宰病猪的血、肉和内脏，废水、废料污染的饲料和饮水都可散播病毒。猪瘟主要通过接触传播，经消化道感染。此外，患病和弱毒株感染的母猪也可以经胎盘感染胎儿，产生弱仔猪、死胎、木乃伊胎等。急性病例在１周～２周内死亡，亚急性和慢性病例，病程可长达２周～４周，甚至数月。４．２ 临床症状ＣＳＦＶ在所有年龄猪中传播，典型症状为发热、倦怠、结膜炎、厌食、呕吐、腹泻、呆滞和步履蹒跚等。出现临床症状后数天，在眼、腹和大腿内侧会出现紫色斑点。非典型症状则没有体温升高现象，但猪呈渐进性消瘦。１犛犖／犜１３７９—２０１０４．３ 病理变化急性病例病理变化不明显或缺乏。典型病例淋巴结呈大理石样红色变化，心外膜、肾、膀胱浆膜、皮下和真皮下出血；亚急性和慢性病例，除有以上病变外，还会在胃肠道粘膜、会咽和喉粘膜中出现坏死性或“纽扣”状溃疡。根据流行病学、临床症状和病理变化可作出ＣＳＦ的初步诊断，但确诊应经实验室试验。５ 实验室诊断５．１ 荧光抗体试验５．１．１ 仪器和试剂５．１．１．１ 荧光显微镜。５．１．１．２ 冷冻切片机。５．１．１．３ ＣＳＦＶ荧光抗体结合物。５．１．１．４ ＰＢＳ（见Ａ．１），实验用水应符合ＧＢ／Ｔ６６８２规定。５．１．１．５ 碳酸盐甘油缓冲液（见Ａ．２）。５．１．１．６ 丙酮（分析纯）。５．１．１．７ 载玻片、盖玻片。５．１．２ 试验程序５．１．２．１ 取样取病猪的扁桃体、脾、肾等病料置冰箱内待检。每一试验都应设阳性和阴性组织样品切片作为对照。５．１．２．２ 样品处理在实验室内将样品组织块修剪出约１ｃｍ×１ｃｍ×０．５ｃｍ的小块，不经任何固定处理，用冷冻包埋剂包埋或加上蒸馏水置于冰盒中，让组织块在冰盒中冷冻。５．１．２．３ 切片将组织块切成４μｍ以下切片，置于１０ｍｍ×３２ｍｍ一角切除的洁净盖玻片上。所有切片以相同的方式放置（如缺口朝右向上）。５．１．２．４ 固定置丙酮中室温固定１０ｍｉｎ或３７℃空气干燥２０ｍｉｎ。５．１．２．５ 浸润将切片在ＰＢＳ中浸润片刻，用吸水纸吸去多余的水分，放在湿盒中的架子上。５．１．２．６ 加猪瘟荧光抗体结合物滴加工作浓度的猪瘟荧光抗体结合物到切片上，在密闭的湿盒中３７℃作用３０ｍｉｎ。若需要加第二ＦＩＴＣ结合物，置室温下２ｍｉｎ，用ＰＢＳ洗５次。然后滴加工作浓度的ＦＩＴＣ结合物，在密闭的湿盒中３７℃作用３０ｍｉｎ。室温下再用ＰＢＳ洗５次，每次２ｍｉｎ。２犛犖／犜１３７９—２０１０５．１．２．７ 封片自然干燥后，用碳酸盐甘油缓冲液封片。荧光显微镜观察结果。５．１．２．８ 结果判定ＣＳＦ阳性切片细胞胞浆内呈现亮绿或黄绿色荧光。在扁桃体隐窝上皮细胞、肾脏皮质远端及近端小管和髓质集尿管细胞、回肠腺体上皮细胞、脾脏动脉周围淋巴样鞘的类淋巴细胞等细胞的细胞浆内呈现亮绿色荧光的样品，可判为阳性；细胞浆内无亮绿色荧光的样品为阴性；细胞浆内呈现弱的黄绿色荧光的样品为可疑；可疑结果经过重复试验，细胞浆内仍呈现弱的黄绿色荧光可判为阳性。５．２ 单克隆抗体免疫过氧化物酶试验５．２．１ 仪器和试剂５．２．１．１ 显微镜。５．２．１．２ 冷冻切片机。５．２．１．３ ＨＲＰＯ结合ＣＳＦ毒株、ＣＳＦ疫苗株、ＢＶＰ／ＢＤ毒株的３种特异性单克隆抗体。５．２．１．４ ＨＲＰＯ结合的抗ＣＳＦＶ免疫球蛋白多克隆抗体。５．２．１．５ 染色底物（配制见Ａ．３）。５．２．１．６ ５％马血清。５．２．１．７ 丙酮（分析纯）、醋酸钠、吐温８０。５．２．１．８ ＰＢＳ（见Ａ．１）。５．２．２ 试验程序５．２．２．１ 取样取８个或更多切成４μｍ的ＦＡＴ阳性扁桃体冰冻切片，如果取不到扁桃体也可用其他阳性器官。５．２．２．２ 固定在丙酮中将切片用飞片法固定１０ｍｉｎ，空气中干燥。５．２．２．３ 犎犚犘犗抗体结合物工作液的制备分别制备３种单克隆抗体ＨＲＰＯ结合物和多克隆抗体ＨＲＰＯ结合物工作液，稀释液为ＰＢＳ（含０．０１％吐温８０和５％马血清，ｐＨ７．６）。５．２．２．４ 加犎犚犘犗抗体结合物用ＰＢＳ冲洗切片，将单抗结合物工作液滴加到整个切片，每种单抗加２个切片，另２切片滴加多抗结合物工作液作为对照。湿盒中３７℃作用６０ｍｉｎ。５．２．２．５ 洗涤用ＰＢＳ洗板６次，每次１０ｓ。５．２．２．６ 加底物溶液室温下用新配置的染色底物溶液染色５ｍｉｎ～１５ｍｉｎ。３犛犖／犜１３７９—２０１０５．２．２．７ 洗涤和固定用０．０５ｍｏｌ／Ｌ醋酸钠（ｐＨ５．０）溶液冲洗。蒸馏水冲洗后将切片固定在载玻片上。５．２．２．８ 观察光学显微镜下检查结果，扁桃体隐窝上皮细胞有暗红着色判为阳性。５．２．２．９ 结果判定结果判定见表１。表１ 犆犛犉犞野毒株、疫苗株和犅犞犇／犅犇毒株的鉴别多克隆抗体特异性单克隆抗体ＣＳＦ毒株ＣＳＦ疫苗株ＢＶＤ／ＢＤ毒株判定＋＋＋＋＋＋－－－＋－－－－＋－ＣＳＦ野毒ＣＳＦ疫苗毒ＢＶＤ／ＢＤ株非ＣＳＦ瘟病毒 注：＋表示阳性，－表示阴性。５．３ 病毒分离试验５．３．１ 仪器和试剂５．３．１．１ 倒置荧光显微镜。５．３．１．２ 离心机。５．３．１．３ 二氧化碳培养箱。５．３．１．４ 恒温培养箱。５．３．１．５ 高压灭菌锅。５．３．１．６ Ｌｅｉｇｈｔｏｎ管，载玻片、盖玻片。５．３．１．７ ＣＳＦ荧光抗体，由指定单位提供。５．３．１．８ ＣＳＦ阳性、阴性参照血清，由指定单位提供。５．３．１．９ ＰＫ１５细胞。５．３．１．１０ 细胞稀释液（见Ａ．４）。５．３．１．１１ 细胞生长液（见Ａ．５）。５．３．１．１２ 细胞消化液（见Ａ．６）。５．３．１．１３ 碳酸盐甘油缓冲液（见Ａ．２）。５．３．１．１４ 丙酮（分析纯）。５．３．１．１５ ＰＢＳ（见Ａ．１）。５．３．２ 组织样品细胞培养免疫荧光试验程序５．３．２．１ 取样和样品处理取１ｇ～２ｇ扁桃体等组织，切成小块放在灭菌洁净研钵中，加入少量灭菌的细胞培养液和灭菌砂，４犛犖／犜１３７９—２０１０将其研磨匀浆，也可在４℃下用适宜的捣碎机捣碎。５．３．２．２ 样品的稀释加入细胞稀释液，制成２０％（质量浓度）悬液。混合液置室温１ｈ。５．３．２．３ 离心１０００犵离心１５ｍｉｎ，取上清液备用。５．３．２．４ 制备细胞悬液用细胞消化液消化培养３ｄ～４ｄ的ＰＫ１５细胞，在显微镜下用细胞计数器计算细胞密度，而后用细胞生长液制成２×１０６个细胞／ｍＬ的细胞悬液，置４℃备用。５．３．２．５ 接种９份细胞悬液与１份上清液（见５．３．２．３制备）混合，接种６支～８支含盖玻片的Ｌｅｉｇｈｔｏｎ管或其他适宜的细胞培养瓶，每管接种１．０ｍＬ～１．５ｍＬ混合液。另３支管只接种１．０ｍＬ～１．５ｍＬ细胞悬液作对照。样品接种完成后，再用ＣＳＦＶ接种３支管作为阳性对照。仔细操作避免该阳性病毒悬浮液引起的交叉污染。此外，还应设立ＣＳＦＶ阴性的细胞培养液对照管。５．３．２．６ 洗涤接种后１ｄ、２ｄ、３ｄ分别将２管培养物及１管对照细胞用细胞稀释液或ＰＢＳ洗涤２次，每次５ｍｉｎ。５．３．２．７ 固定取出含有细胞的盖玻片，置于预冷的丙酮中固定１０ｍｉｎ，自然干燥。将细胞培养玻片在ＰＢＳ液中浸润，用吸水纸吸去周边多余的水分，放入湿盒。５．３．２．８ 滴加工作浓度的犆犛犉荧光抗体滴加工作浓度的ＣＳＦ荧光抗体到湿盒中的细胞培养玻片上（细胞培养玻片盖在滴加有ＰＢＳ液的载玻片上）。３７℃温箱中作用３０ｍｉｎ。５．３．２．９ 洗涤和封片室温下用ＰＢＳ液洗５遍，每次２ｍｉｎ。自然干燥后，用碳酸盐甘油缓冲液封片，检查荧光。５．３．２．１０ 结果判定细胞培养玻片标本上，成簇（约１０个～１５个细胞）的细胞胞浆内呈现明亮的黄绿色荧光的样品为阳性；细胞浆内无黄绿色荧光的样品为阴性；细胞浆内呈现弱的黄绿色荧光为可疑；可疑结果需重复试验，细胞浆内仍呈现弱的黄绿色荧光的样品判为阳性。进行病毒分离时，可用平底微量滴定板或２４孔板代替Ｌｅｉｇｈｔｏｎ管。微量滴定板的固定和染色方法与ＮＰＬＡ方法相同。如果２％扁桃体悬液对细胞有毒性作用，则应将提高悬液稀释度或用其他器官重做。５．３．３ 全血或白细胞碎片分离病毒操作程序５．３．３．１ 取－２０℃冻存的全血或白细胞碎片样品置３７℃水浴融化。５犛犖／犜１３７９—２０１０５．３．３．２ 在培养有ＰＫ１５单层细胞的２４孔板中接种３００μＬ血样；３７℃吸附１ｈ。５．３．３．３ 弃去接种液，用细胞稀释液洗涤细胞，然后加细胞生长液。５．３．３．４ 细胞板孵育３ｄ～４ｄ后，如ＮＰＬＡ所述方法洗板、固定和染色，检查荧光。５．３．３．５ 按５．３．２．１０判定结果。５．４ 荧光抗体病毒中和试验５．４．１ 仪器和试剂５．４．１．１ 倒置荧光显微镜。５．４．１．２ 二氧化碳培养箱。５．４．１．３ 恒温培养箱。５．４．１．４ 微量板振荡器。５．４．１．５ ９６孔微量细胞培养板。５．４．１．６ ＰＫ１５细胞。５．４．１．７ 猪瘟Ｔｈｉｖｅｒｖａｌ弱毒冻干株，由指定单位提供。５．４．１．８ ＣＳＦ阳性、阴性参照血清，由指定单位提供。５．４．１．９ ＣＳＦ荧光抗体，由指定单位提供。５．４．１．１０ 细胞稀释液（见Ａ．４）。５．４．１．１１ 细胞生长液（见Ａ．５）。５．４．１．１２ 细胞消化液（见Ａ．６）。５．４．１．１３ 丙酮固定液（见Ａ．７）。５．４．１．１４ ＰＢＳ（见Ａ．１）。５．４．２ 试验程序５．４．２．１ 取样和样品处理无菌取被检猪血液，分离血清，试