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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准!!#!!!#$!$代替!!#$$%$&$’(()#!!#$$%$&’’(()#!!#$$%$&)’(()口蹄疫检疫技术规范$%&’&()*(+,’-)-.-/0-’0--)&(12-%)31*4+&4+#$!$5!!5$!发布#$!!5$%5$!实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前!!言!!本标准按照!!#$%$&’’(给出的规则起草#本标准代替)*!#$$+$%$&’’,$口蹄疫病毒感染抗体检测方法琼脂免疫扩散试验%&)*!#$$+$%&&’’,$口蹄疫病毒抗体检测方法!微量血清中和试验%&)*!#$$+$%,&’’,$食道咽部口蹄疫病毒探查试验%#本标准与)*!#$$+$%$&’’,&)*!#$$+$%&&’’,和)*!#$$+$%,&’’,相比’主要技术变化如下(增加了口蹄疫病毒分离及鉴定)增加了酶联免疫吸附试验)增加了反转录-聚合酶链反应)增加了荧光反转录-聚合酶链反应)增加了固相竞争酶联免疫吸附试验)增加了液相阻断酶联免疫吸附试验#本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口#本标准起草单位(中华人民共和国深圳出入境检验检疫局&中华人民共和国珠海出入境检验检疫局&中华人民共和国云南出入境检验检疫局#本标准主要起草人(花群义&阮周曦&卢体康&杨素&罗宝正&徐海聂&周晓黎&杨云庆&曾少灵&曹琛福&陈兵&陶虹#本标准所代替标准历次版本发布情况为()*!#$$+$%$&’’,))*!#$$+$%&&’’,))*!#$$+$%,&’’,#!!!#!!!#$!$口蹄疫检疫技术规范!!范围本标准规定了口蹄疫病毒分离及鉴定&酶联免疫吸附试验&反转录-聚合酶链反应&荧光反转录-聚合酶链反应&病毒中和试验&固相竞争酶联免疫吸附试验&液相阻断酶联免疫吸附试验和琼脂免疫扩散试验的技术规范#本标准适用于口蹄疫检疫##!规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的#凡是注日期的引用文件’仅注日期的版本适用于本文件#凡是不注日期的引用文件’其最新版本*包括所有的修改单+适用于本文件#!!#..+&!分析实验室用水规格和试验方法%!缩略语下列缩略语适用于本文件#/0-&$(幼仓鼠肾细胞1234(焦碳酸二乙酯561(口蹄疫5617(口蹄疫病毒83(食道咽部黏液#491:’(半数组织培养感染量##2(三氯三氟乙烷&!病毒分离及鉴定&%!!设备器材生物安全柜&二氧化碳培养箱&倒置显微镜&高速冷冻离心机&食道探杯&:;耐冷冻密封瓶&&:;细胞培养瓶或&=孔细胞培养板等#&%#!材料与试剂除特别说明以外’本标准所用试剂均为分析纯’试验用水应符合!!#..+&二级水的规定#&%#%!!运输保存液(配制见附录#&%#%#!细胞(敏感的细胞培养系统包括原代牛甲状腺细胞和原代猪&犊牛和羔羊肾细胞#已建立的细胞系如/0-&$和9-?)-&细胞也可以使用#&%#%%!硫乙醇酸盐*#%!+培养基&’%:@酚红&/ABC,D溶液&’%:@-/&E%:@碳酸氢钠溶液&细胞培养基&细胞维持液&胰蛋白酶溶液&抗生素等’配制见附录#$!!#!!!#$!$&%#%&!三氯三氟乙烷*##2+#&%%!样品的采集和处理&%%%!!样品的采集&保存&运送方法和要求见附录#&%%%#!83液样品的处理(将样品与等量的##2混合’用组织捣碎机$’’’’F!;GB乳化,;GB’,’’’F!;GB离心$’;GB’取上清液用于接种细胞&乳鼠或用于其他试验#&%%%%!水泡皮的处理(从:’@3)-甘油中取出上皮样品’用灭菌滤纸吸去甘油#无菌称量后剪碎’加入少量组织培养液和抗菌素磨成糊状’制备成$’@的组织悬液’以,’’’F!;GB离心$’;GB#取上清液接种细胞培养物&乳鼠或用于其他试验#&%%%&!水泡液的处理(无菌采集的新鲜水泡液可不作任何处理’直接使用#若水泡液不清洁’则需,’’’F!;GB离心:;GB$’;GB’并加入抗生素#如果水泡液太少’可加入不含血清的细胞培养液稀释’稀释倍数越少越好#&%%%’!组织样品的处理(在无菌室内将采集的动物组织’如淋巴结&肌腱&肌肉等除去被膜及其他结缔组织’尽量选取中心洁净的部分’分别磨碎’同上制成$’@的组织悬液’离心备用#&%&!细胞培养分离$%&’&%&%!!犊牛甲状腺细胞的培养&%&%!%!!以无菌术切开初生犊牛颈部腹侧’将甲状腺连同喉头一起剪下送入实验室#&%&%!%#!在生物安全柜中将喉软骨两侧新鲜甲状腺剪下’用H/E%&E%=的含抗生素的灭菌水解乳蛋白溶液-/冲洗血迹’在无菌条件下剪下带被膜的两侧腺体’小心剪去被膜’分离腺体组织’去掉脂肪和结缔组织’称量’一般采集$’I$:I即可#&%&%!%%!用H/E%&E%=的含抗生素的灭菌-/冲洗,次后’将其尽可能地剪碎’再冲洗,次#&%&%!%&!离心去掉液体’转入三角瓶’加入$’倍量的’%:@的胰蛋白酶溶液’磁力搅拌$’;GB’弃去上清液#&%&%!%’!加入等量胰蛋白酶溶液于,EJ下正式消化#在慢速磁力搅拌下消化,’;GB.’;GB’收集上层悬液’以$’’’F!;GB离心:;GB’弃上清液’用细胞培养基重悬沉淀#&%&%!%(!反复消化=次:次’将消化的细胞悬液配制成$K$’:个细胞簇!;为宜*每个细胞簇由,个:个细胞组成+#&%&%!%)!&:;培养瓶加:;悬液’&=孔板每孔加$;悬液#前者可置,EJ培养箱中培养’后者应置二氧化碳培养箱中培养#&%&%!%!待细胞长成单层时即可使用#&%&%!%*!原代猪肾细胞&原代犊牛肾细胞和原代羔羊肾细胞的培养可参照犊牛甲状腺细胞的培养方法#&%&%#!样品接种&%&%#%!!弃去细胞培养基’用细胞维持液冲洗细胞单层一次#&%&%#%#!&:;培养瓶中加$;处理过的样品上清液#如使用&=孔板则每孔加’%&;处理过的样品上清液#&%&%#%%!经,EJ吸附.’;GB’前者补加=;维持液’置,EJ培养箱培养’后者补加’%+;维持液’置二氧化碳培养箱中培养#&!!#!!!#$!$&%&%%!结果观察一般&=L=+L即可出现432’即类上皮细胞圆缩&散布’最后脱落*成纤维细胞仍可能保持正常+#如无432则需盲传一代#如盲传后仍未出现432’则判为5617阴性#将收获的培养物M&’J以下保存#&%&%&!培养物的鉴定由于肠道病毒和鼻病毒均可引起相同的432’所以收获的培养物应进行鉴定#可使用反转录-聚酶链反应*?#-34?+&病毒中和试验和酶联免疫吸附试验*29)+等方法来具体鉴定出口蹄疫的型别#&%’!乳鼠分离$%&’取&日E日龄未断奶)35乳鼠$’只’于颈背部皮下接种=%,处理过的样品上清液’%&;#$+L后每隔$L&L检查一次#如果样品内含有5617’接种鼠一般在&’L,’L出现典型的561症状’发病鼠运动不灵活’四肢麻痹’呼吸促迫’最后死亡#将发病死亡的乳鼠仰卧固定’用E:@酒精棉球消毒皮肤’由正中线剪开皮肤’剥离皮肤’除去头&四肢&内脏’取骨骼肌作为接种材料#接种乳鼠’视乳鼠发病及死亡时间盲传$代,代#再以发病致死乳鼠组织为抗原材料鉴定病毒的血清型#’!酶联免疫吸附试验’%!!仪器与器材酶标仪*可检测=(&B;+&微量移液器&细胞培养箱&旋转振荡器&=J冰箱等#’%#!材料与试剂’%#%!!样品(样品采集见附录#’%#%#!捕获抗体(用561病毒E个血清型$=.)抗原的兔抗血清’将该血清用H/(%.碳酸盐-重碳酸盐缓冲液*配制见附录+稀释成最适浓度#’%#%%!对照抗原(从561病毒的E个型的每一种型中选出一些毒株’用(/0-&$单层细胞培养繁殖制备#如果需要’加上猪水泡病*)71+病毒和水泡性口炎*7)+病毒’用9-?)-&细胞繁殖制备#’%#%&!豚鼠抗血清(用某一个血清型561病毒的$=.)抗原接种豚鼠制备豚鼠抗血清’用正常牛血清阻断#预先用含’%’:@吐温-&’&:@脱脂奶的#3)#6*配制见附录+将该血清稀释成最适浓度#’%#%’!酶结合物(兔抗豚鼠9I-辣根过氧化物酶*/?3+结合物’用正常牛血清阻断’用3)#6稀释成最适浓度#’%#%(!底物溶液(配制见附录#’%%!操作方法’%%%!!H/(%.碳酸盐-重碳酸盐缓冲液稀释兔抗病毒血清’将8&&4&南非$&南非&&南非,&亚洲9和)71&7)病毒*选择使用+抗血清分别包被29)板到/排’每孔:’##’%%%#!=J过夜或在,EJ旋转振荡器中以$’’F!;GB&’’F!;GB孵育$L#’%%%%!制备被检样品悬浮液*即$’@的原始样品悬液或未稀释的澄清的细胞培养上清液+#’%%%&!用3)洗板:次#’%%%’!加样(’%%%’%!!每块板第=&+和$&列各孔加:’#3)##另外’板$的到/排的&和,孔加:’#3)#’板$的排的第$孔加:’#对照8型抗原’排第&孔加$&%:#的对照8型抗原#将第&孔抗原与稀释液混合后移出$&%:#到排的第,孔#混合后’从第,孔弃去$&%:#*这时8型抗,!!#!!!#$!$原:倍系列稀释+#型抗原也一样’型抗原:’#加到排的第$孔’$&%:#加到第&孔’然后混合’从第&孔移出$&%:#到第,孔*像前面8型抗原那样进行+#继续对4&南非$&南非&&南非,&亚洲9和)71&7)*如果需要+操作#每种抗原需要更换吸头#剩下的板孔加被检样品’:’#样品$加到到/排的:’.’E孔中’样品&加到到/排的(’$’’$$孔中#’%%%’%#!如果有&个以上的样品同时做试验时’29)板应如下排列(:’#3)#加到到/排的=&+列和$&列*缓冲液对照列+#注意该板不需要对照抗原#这些被检样品:’#分别加在到/排的$&&&,&:&.&E&(&$’&$$列中#’%%%(!加盖’置,EJ旋转振荡器中振荡$L#’%%%)!如前用3)洗涤,次之后’甩去残留洗液’将板吸干#’%%%!按顺序’每块板分别加入:’#豚鼠抗血清’例如到/排*8&&4&南非$&南非&&南非,&亚洲9+血清型和)71&7)病毒*任选+的抗血清#’%%%*!加盖’置旋转振荡器’,EJ振荡$L#’%%%!$!用3)洗板,次#每孔加入:’#’辣根过氧化物酶结合的兔抗豚鼠免疫球蛋白’置旋转振荡器’,EJ孵育$L#’%%%!!!用3)洗板,次#每孔加入:’#的底物液’置暗处#’%%%!#!$:;GB后’加:’#$%&:;NO!硫酸终止反应#在酶标仪=(&B;下读光吸收值*81值+#’%&!结果判定’%&%!!被检样品81值比背景大’%$以上时’判为阳性反应#’%&%#!被检样品81值减背景81值接近’%$时’应重做’或用组织培养物传代扩增抗原’当出现细胞病变效应*432+时’检测上清液#’%&%%!被检样品81值减背景81值小于’%$时’判为阴性反应#(!反转录(聚合酶链反应(%!!仪器与器材34?扩增仪&凝胶电泳仪&水平电泳槽&凝胶成像管理系统&高速台式冷冻离心机*离心速度$&’’’F!;GB以上+&台式离心机&手掌式离心机&混匀器&旋涡振荡器&微量可调移液器*$’#&$’’#&$’’’#+及配套带滤芯吸头#(%#!材料与试剂所有试剂均用无?*酶污染的容器*用1234水处理后高压灭菌+分装#可以使用商品化试剂盒’也可自行配制下列试剂#(%#%!!#?9PNO裂解液#(%#%#!三氯甲烷#(%#%%!异丙醇(M&’J预冷#(%#%&!3)($%’,=K$’:3A’$:;GB高压灭菌冷却后’无菌条件下加入青霉素&链霉素各$’’’’Q!;#(%#%’!E’@乙醇(用新开启的无水乙醇和’%$@1234水配制’M&’J预冷#(%#%(!糖原(&’;I!;#(%#%)!1234水(’%$@’三蒸水配制’室温静置过夜’$%’,=K$’:3A高压&’;GB’冷却备用#(%#%!乙酰化牛血清白蛋白($;I!;#(%#%*!R*#3D(含R4#3&R!#3&R#3&R##3各$’;;NO!#(%#%!$!1##($;NO!#(%#%!!