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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１１６６—２０１０代替ＳＮ／Ｔ１１６６．１—２００２，ＳＮ／Ｔ１１６６．２—２００２，ＳＮ／Ｔ１１６６．３—２００６水泡性口炎检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉狏犲狊犻犮狌犾犪狉狊狋狅犿犪狋犻狋犻狊２０１０１１０１发布２０１１０５０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准代替ＳＮ／Ｔ１１６６．１—２００２《水泡性口炎补体结合试验操作规程》、ＳＮ／Ｔ１１６６．２—２００２《水泡性口炎微量血清中和试验操作规程》和ＳＮ／Ｔ１１６６．３—２００６《水泡性口炎逆转录聚合酶链反应操作规程》。 本标准与ＳＮ／Ｔ１１６６．１—２００２、ＳＮ／Ｔ１１６６．２—２００２和ＳＮ／Ｔ１１６６．３—２００６相比，主要技术变化如下：———增加了水泡性口炎的病毒分离及鉴定；———增加了荧光反转录聚合酶链反应；———增加了竞争酶联免疫吸附试验。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国云南出入境检验检疫局。本标准主要起草人：花群义、阮周曦、杨俊兴、杨云庆、秦智锋、吕建强、曾少灵、林庆燕、宗卉、张彩虹、周晓黎、董俊。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ／Ｔ１１６６．１—２００２；———ＳＮ／Ｔ１１６６．２—２００２；———ＳＮ／Ｔ１１６６．３—２００６。Ⅰ犛犖／犜１１６６—２０１０水泡性口炎检疫技术规范１ 范围本标准规定了动物水泡性口炎的病毒分离及鉴定、反转录聚合酶链反应、荧光反转录聚合酶链反应、中和试验、竞争酶联免疫吸附试验的技术要求。本标准适用于动物水泡性口炎的检验检疫。２ 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ１８０８８ 出入境动物检疫采样３ 缩略语以下缩略语适用于本文件。ＢＨＫ２１：仓鼠肾细胞ＢＬＰ：乳糖蛋白胨缓冲肉汤ＣＰＥ：致细胞病变作用Ｃｔ值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数ｃＥＬＩＳＡ：竞争酶联免疫吸附试验ＤＥＰＣ：焦碳酸二乙酯ＭｃＡｂ：单克隆抗体ＯＤ值：光密度值ＰＩ：抑制百分比ＴＣＩＤ５０：半数组织培养感染量Ｖｅｒｏ：非洲绿猴肾细胞ＶＳＶ：水泡性口炎病毒ＶＳＶＩＮＤ：水泡性口炎病毒印地安那型ＶＳＶＮＪ：水泡性口炎病毒新泽西型４ 病毒分离与鉴定４．１ 病毒分离４．１．１ 样品的采集：按ＧＢ／Ｔ１８０８８进行。主要采集动物口、蹄冠上或乳头上的水泡上皮组织。采集后立即冷藏送检或置碳酸缓冲甘油（配方见附录Ａ）中低温保藏。采集到的水泡液置灭菌瓶中，冷藏送检或低温保藏。若从冻肉中采样，可采淋巴结或组织；采集的精液样品应不少于１ｍＬ，冻精样品每头每批次取样３管～５管；无症状或无水泡的活动物采集抗凝全血，胚胎及其冲洗液。４．１．２ 样品的处理：将采集到的上皮、淋巴结或组织样品，经研磨后用０．０１ｍｏｌ／ＬｐＨ７．２的ＰＢＳ（配１犛犖／犜１１６６—２０１０制见附录Ａ）配制成２０％的悬液。精液用乳糖蛋白胨缓冲肉汤（ＢＬＰ，配制见附录Ａ）作１∶５稀释后，经８０００ｒ／ｍｉｎ４℃离心３０ｍｉｎ，弃上清液，并弃去浮游脂肪，再用ＢＬＰ作１∶５稀释成悬液；水泡液、胚胎冲洗液无需处理，全血用ＢＬＰ作１∶５稀释后，直接用于病毒的分离或鉴定。４．１．３ 接种细胞：澄清组织悬液或水泡液与抗生素（含青霉素２０００ＩＵ／ｍＬ、链霉素２０００μｇ／ｍＬ）４℃作用３０ｍｉｎ，接种于ＢＨＫ２１或Ｖｅｒｏ细胞单层，３７℃５％二氧化碳培养箱吸附１ｈ，弃去接种物，用细胞培养液洗涤三次，然后加入维持液，置于３３℃～３５℃５％二氧化碳培养箱中继续培养。４．２ 病毒鉴定采用反转录聚合酶链反应和荧光反转录聚合酶链反应进行病毒分离物的鉴定。接种后２ｄ～３ｄ出现ＣＰＥ，需进行鉴定。如无ＣＰＥ，则盲传三代，仍无ＣＰＥ，则判为ＶＳＶ阴性。５ 反转录聚合酶链反应５．１ 试剂和材料５．１．１ 水泡性口炎病毒标准株新泽西型（ＮＪ）和印第安那型（ＩＮＤ）标准病毒株。５．１．２ 犜犪狇酶－２０℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。５．１．３ 逆转录酶ＡＭＶ－２０℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。５．１．４ ＲＮＡ抑制剂（ＲＮａｓｉｎ）－２０℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。５．１．５ ｄＮＴＰ（含ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ各１０ｍｍｏｌ／Ｌ）５．１．６ 引物５．１．６．１ 选用水泡性口炎病毒Ｌ蛋白基因较保守的序列为ＰＣＲ扩增区。采用半套式ＲＴＰＣＲ方法，半套式引物分别根据ＮＪ株和ＩＮＤ株扩增区的碱基差别设计。外侧引物Ⅰ（Ｐ１）：５’ＡＡＧＧＣＴＣＴＣＴＧＴＴＴＣＣＧＧＡＴＣＴＧＧ３’；外侧引物Ⅱ（Ｐ２）：５’ＴＧＡＴＴＣＡＡＴＡＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴＧＧＧＡＣ３’；ＮＪ半套式引物（Ｐ３）：５’ＴＧＴＴＣＴＧＧＴＧＴＧＣＡＡＡＣＣＡＧＧＴＡＴＣ３’；ＩＮＤ半套式引物（Ｐ４）：５’ＡＧＴＡＧＡＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＣＣＣＧＧＴＡＴＣ３’。５．１．６．２ 用ＤＥＰＣ水将引物配制成浓度为２５ｐｍｏｌ／μＬ。５．１．７ 三氯甲烷（氯仿）。５．１．８ ７５％乙醇：用新开启的无水乙醇和ＤＥＰＣ水配制，－２０℃预冷。５．１．９ 异戊醇：使用前预冷到－２０℃。５．１．１０ 变性液、５倍ＡＭＶ逆转录酶浓缩缓冲液、犜犪狇酶用１０倍浓缩缓冲液、ＴＢＥ电泳缓冲液、ＥＢ核酸染色液、上样缓冲液、ＤＥＰＣ处理水等。配制方法见附录Ａ。５．２ 器材和设备ＰＣＲ扩增仪、电泳仪、微量移液器及吸头、凝胶图像分析仪、恒温培养箱、普通冰箱和低温冰箱、电动匀浆器或组织研磨器、离心机和离心管等。５．３ 操作方法５．３．１ 被检样品的采集和处理５．３．１．１ 被检样品的采集：样品主要采集动物口、蹄冠上或乳头上的水泡上皮组织，采集后立即冷藏送２犛犖／犜１１６６—２０１０检或置缓冲甘油（用０．０１ｍｏｌ／ＬｐＨ７．２的ＰＢＳ配制的５０％的甘油溶液）中低温保藏；采集到的水泡液置灭菌瓶中，冷藏送检或低温保藏；若从冻肉中采样，可采集淋巴结或组织；无症状或无水泡的活动物采集抗凝全血。５．３．１．２ 被检样品的处理：将采集到的上皮、淋巴结或组织样品，经研磨后用０．０１ｍｏｌ／ＬｐＨ７．２的ＰＢＳ配制成２０％的悬液。全血、胚胎及其冲洗液、细胞培养物无需处理；取４５０μＬ样品悬液放入１．５ｍＬ的离心管，再加入４５０μＬ变性液并混匀，旋涡振荡混合２０ｓ，冰浴１５ｍｉｎ。５．３．２ 对照样品制备和处理５．３．２．１ 阳性对照样品制备：将水泡性口炎病毒ＮＪ型和ＩＮＤ型分别接种ＢＨＫ２１或Ｖｅｒｏ细胞单层，３７℃吸附１ｈ后加入维持液，置５％二氧化碳培养箱３７℃培养，逐日观察。待ＣＰＥ达７５％以上，冻融两次，收获细胞培养病毒悬液，分装成１ｍＬ小瓶，置－７０℃保存备用。５．３．２．２ 阴性对照样品制备：制备ＢＨＫ２１或Ｖｅｒｏ细胞单层，弃去细胞培养液，加入维持液，置５％二氧化碳培养箱３７℃培养３ｄ，冻融两次，收获细胞悬液，分装成１ｍＬ小瓶，置－７０℃保存备用；或采集相同动物的组织样品作为阴性对照样品。５．３．２．３ 对照样品的处理：取４５０μＬ阳性和阴性对照样品细胞悬液放入１．５ｍＬ的离心管，再加入４５０μＬ变性液并混匀，旋涡振荡混合２０ｓ，冰浴１５ｍｉｎ。５．３．３ 犚犖犃提取５．３．３．１ 取２５０μＬ处理后的样品置１．５ｍＬｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，作好标记，同时设立阳性样品、阴性样品对照，加入３倍体积Ｔｒｉｚｏｌ，振荡混合２０ｓ，静置５ｍｉｎ。５．３．３．２ 加入２００μＬ三氯甲烷，振荡混合２０ｓ，静置５ｍｉｎ；４℃１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，取上清液置另一个标记好的１．５ｍＬｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，加入等体积异丙醇，－２０℃静置１５ｍｉｎ。５．３．３．３ ４℃１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，轻轻弃上清液，加１ｍＬＤＥＰＣ水配制的７５％乙醇。５．３．３．４ ４℃１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，小心弃去乙醇，倒置滤纸上，烘干，加２０μＬＤＥＰＣ水溶解，立即进行ｃＤＮＡ的合成或－８０℃保存备用。５．３．３．５ ＲＮＡ提取也可采用等效的商品化病毒ＲＮＡ提取试剂盒制备ＲＮＡ。５．３．４ 反转录合成犮犇犖犃在ＰＣＲ管中加入１０μＬ反转录模板（样品ＲＮＡ）、１μＬ引物Ｐ２、５μＬ５倍逆转录酶浓缩缓冲液、２μＬｄＮＴＰ、０．５μＬＲＮＡ酶抑制剂（２０Ｕ）、１μＬ逆转录酶ＡＭＶ（１０Ｕ）和０．５μＬ水，总体积为２０μＬ。置于４２℃反转录４５ｍｉｎ，立即冰浴，用作ＰＣＲ模板。５．３．５ 犘犆犚扩增犇犖犃５．３．５．１ ５０μ犔犘犆犚反应液组成１０×犜犪狇酶缓冲液 ５μＬ氯化镁（ＭｇＣｌ２）（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）４μＬｄＮＴＰｓ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）４μＬ引物Ｐ１１μＬ引物Ｐ２１μＬ犜犪狇酶（５Ｕ）１μＬｃＤＮＡ模板５μＬＤＥＰＣ水２９μＬ３犛犖／犜１１６６—２０１０５．３．５．２ 犘犆犚循环参数将ＰＣＲ反应管置于ＰＣＲ扩增仪。９４℃５ｍｉｎ；９４℃４５ｓ、５５℃４５ｓ、７２℃３０ｓ，４０次循环，然后７２℃７ｍｉｎ，最后４℃保存。５．３．６ 犘犆犚产物琼脂糖电泳用ＴＢＥ电泳缓冲液配制２％的琼脂糖（含０．５μｇ／ｍＬＥＢ）平板。将平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将８μＬ样品和２μＬ样品缓冲液混匀后加入样品孔。在电泳时设立ＤＮＡ标准分子量作对照，推荐使用ｐＵＣ１９ＤＮＡ／犕狊狆Ⅰ（犎狆犪Ⅱ）。５Ｖ／ｃｍ电泳约３０ｍｉｎ，当溴酚蓝到达底部时停止。在紫外灯下观察有无２２７ｂｐ的ＤＮＡ片段扩增产物条带。５．３．７ 半套式犘犆犚定型５．３．７．１ ＰＣＲ产物琼脂糖凝胶电泳后，如果看不到２２７ｂｐ的ＤＮＡ条带，取５μＬ产物做模板；如果电泳后能看到２２７ｂｐ的ＤＮＡ带，只是要求进行定型，则需将产物按１∶１０００稀释后，取５μＬ做模板。５．３．７．２ 取两只离心管，一管作新泽西型（ＮＪ）：另一管作印第安那型（ＩＮＤ）：ａ） 新泽西型（ＮＪ）定型的ＰＣＲ反应管中依次分别加入以下试剂，配制５０μＬＰＣＲ反应体系：模板（ＰＣＲ产物）５μＬ，犜犪狇酶（５Ｕ）１μＬ，ｄＮＴＰｓ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）２μＬ，引物Ｐ２１μＬ，引物Ｐ３（ＮＪ型）１μＬ，１０×犜犪狇酶缓冲液５μＬ，ＭｇＣｌ２（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）６μＬ，ＤＥＰＣ水２９μＬ；ｂ） 印第安那型（ＩＮＤ）定型的ＰＣＲ反应管中依次分别加入以下试剂，以配制５０μＬＰＣＲ反应体系：模板（ＰＣＲ产物）５μＬ、犜犪狇酶１μＬ（５Ｕ）、ｄＮＴＰｓ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）２μＬ、引物Ｐ２１μＬ、引物Ｐ４（ＩＮＤ型）１μＬ，１０×犜犪狇酶缓冲液５μＬ，２５ｍｍｏｌ／Ｌ的ＭｇＣｌ２６μＬ、ＤＥＰＣ水２９μＬ。５．３．７．３ 将ＰＣＲ反应管置于ＰＣＲ扩增仪。９４℃４ｍｉｎ；９４℃３０ｓ、５５℃４５ｓ、７２℃４５ｓ，３０次循环，然后７２℃５ｍｉｎ，最后４℃保存。５．３．７．４ 如同５．３．６，用ＴＢＥ电泳缓冲液配制２％的琼脂糖（含０．５μｇ／ｍＬＥＢ）平板进行电泳检测。５．３．８ 设立对照５．３．８．１ 从５．３．３ＲＮＡ抽提开始，就应设立阳性对照、阴性对照。以含有已知新泽西型（ＮＪ）和印第安那型（ＩＮＤ）病毒株的细胞悬液作为阳性对照，用正常的ＢＨＫ２１或Ｖｅｒｏ细胞悬液作为阴性对照。５．３．８．２ 只有在对照成立的情况下，试验有效，可进行结果判定。５．４ 结果判定５．４．１ ＰＣＲ后阳性对照会出现一条２２７ｂｐ的ＤＮＡ片段。阴性对照没有该核酸带。５．４．２ 半套式ＰＣＲ后，与引物相应的血清型病毒的阳性对照会出现一条１１９ｂｐ的ＤＮＡ片段。阴性对照没有该核酸带。５．４．３ 待测样品ＰＣＲ扩增后，如能在相应２２７ｂｐＤＮＡ位置上有带，即可作出定性。半套式ＰＣＲ后如出现一条１１９ｂｐ的ＤＮＡ片段，即可定型为与引物相应的血清型。５．４．