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水稻茎线虫检疫鉴定方法MethodsforquarantineandidentificationofDitylenchusangustus(Butler)FilipjevSN／T1136—2002前 言 本标准的附录B和附录C为规范性附录，附录A为资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、南京农业大学。本标准主要起草人：戚龙君、宋绍秫、林茂松。 本标准系首次发布的检验检疫行业标准。1 范围 本标准规定了对水稻茎线虫检疫和鉴定方法。 本标准适用于稻种以及稻草、稻草编织成的袋、绳、席等包装物中水稻茎线虫的检疫和鉴定。2原理 水稻茎线虫Ricestemnematode，学名：Ditylenchusangustus(Butler，1913)Filipjev，属于线虫门(Nemata)，侧尾腺纲(Secernentea)，垫刃目(Tylenchida)，粒线虫科(Anguinidae)，茎线虫属(Ditylenchus)。其外寄生于水稻，生殖只能在稻株内进行，主要寄居于花梗的基部、茎杆末节以上以及颖片之内，这些地方大多有包括卵到成虫各个阶段的大量线虫。水稻受害后叶面出现浅绿色斑点，叶缘卷缩，叶尖弯曲，整张叶片扭曲或呈畸形，严重时花穗捻转或包在叶鞘内不能抽出，小穗不孕，形成空粒。 本病主要由稻种内潜伏的线虫作远距离传播，通过引种传带到新稻区，还可通过罹病的稻草作远距离传播。土壤中残留的线虫以及带线虫的病稻草、稻茬、种子或混在种子里的病残碎片为当地次年发病的主要来源。它的侵染循环、传播途径、寄主范围(参见附录A)、生物学和形态学特征是该检疫鉴定方法的依据。3仪器、用具3.1生物显微镜(100倍～1000倍，具有目镜测微尺或者绘图仪、监视器等)；3.2体视显微镜(10倍～90倍，具透射光源)；3.3冰箱；3.4凹玻片；3.5试管；3.6载玻片；3.7盖玻片；3.8加热板(80℃以下)；3.9烧杯(500mL、1000mL)；3.10漏斗；3.11漏斗架；3.12研钵；3.13培养皿；3.14剪刀；3.15挑针；3.16干燥器；3.17打空器；3.18酒精灯；3.19乳胶管；3.20纱布；3.21止水夹；3.22指形管；3.23玻璃纤维丝(3mm～5mm)。4药品4.1指甲油；4.2TAF固定液(40％甲醛7mL、三乙醇胺2mL和蒸馏水91mL混合而成)；4.3乳酚油(苯酚20mL、乳酸20mL、甘油40mL和蒸馏水20mL混合而成)；4.4石蜡。5现场检疫5.1抽样5.1.1抽样方法 棋盘式、五点式或随机抽样。5.1.2抽样数量5.1.2.1稻种 按总件数的5％～20％抽样，最低抽检10件。取样的数量为：10kg以下取2kg；11kg～100kg取4kg；101kg～500kg取6kg；501kg～1000kg取8kg：1001kg～2000kg取10kg：2001kg～5000kg取12kg；5001kg～10000kg取14kg：10001kg～100000kg每增加5000kg增取2kg，不足5000kg余量计取2kg；100001kg以上，每增加50000kg增取2kg，不足50000kg余量计取2kg。5.1.2.2稻草及其编织品 按总件数的5％～20％抽样，每次检查不得少于10件且不少于500根。取样的数量为：50根以下取五根：51根～200根取10根；201根～1000根取15根；1001根～5000根取20根；5001根以上，每增加5000根增取五根样品，不足5000根的余量计取五根样品。5.2外观症状的检查5.2.1水稻种子的检查 首先要注意检查褐色畸形种子，其次要看稻种内是否混有稻草或其他水稻残体，同时注意是否夹带泥土等，收集后与采集的样品一并送实验室进行检查。5.2.2稻草及其编织品的检查 注意检查叶鞘颜色异常、叶缘卷缩、叶尖弯曲、整张叶片扭曲或呈畸形、草杆短小的稻草及其编织品。收集上述可疑植物材料及所夹带的土壤等与采集的样品一并带回实验室检验。6实验室检验6.1稻种检验方法6.1.1抽样所得种子，可将稻种去壳，利用漏斗法(按附录B)分离颖壳中可能带有的线虫。分离所得的线虫制成临时玻片(制作方法按附录C)，在显微镜下观察，并根据形态鉴定特征进一步鉴定。6.1.2对于畸形、不饱满的种子，可直接在体视显微镜下解剖，检查有无线虫。如有线虫，制成临时玻片，在显微镜下观察，并根据形态鉴定特征进一步鉴定。6.2稻草及其编织品检验方法6.2.1将采得的样品适当处理成小段，用漏斗法分离。6.2.2收集所分离的线虫，在体视显微镜下观察，并挑取若干条线虫至载玻片上，制成临时玻片，在显微镜下观察，并根据形态鉴定特征进一步鉴定。7形态鉴定特征7.1茎线虫属鉴别特征 雌虫：一般不肥大，不弯成螺旋形，长0．6mm～1.5mm，有的可达2mm；表皮有很细的环纹，侧区有四条至六条刻线；口针细小，多数长度为7μm～11μm；中食道球有或无瓣，偶尔无明显的中食道球，峡部与后食道腺之间无缢缩，后食道腺短或长，不覆盖、短覆盖或长覆盖肠；单生殖腺、前伸，卵巢短或长，有时伸达食道区或转折，卵母细胞一行至二行排列，子宫柱状部有四排细胞(每排四个细胞)，后阴子宫囊有或无。 雄虫：精巢不转折，精细胞大(通常直径3μm～5μm)，交合伞不伸到尾端，延伸至尾长的四分之一至四分之三处。交合刺窄细，基部宽大，其上具特殊的突起。两性尾形相似，呈长圆锥形到近柱形，偶尔丝状，多数c’(尾长÷肛门或泄殖腔处体宽)为4～7。寄主不形成虫瘿。7.2水稻茎线虫形态鉴定特征7.2.1测计值(据Butler，1913)表1水稻茎线虫测计值7.2.2形态描述(见图1) 雌虫：虫体细长、直。侧带区刻线四条。唇区不缢缩。口针发达，针锥细，为口针长的45％，口针基部球小、清晰，微向后倾斜。中食道球卵圆形，肌肉发达，瓣门明显。后食道球长约27μm～34／μm，微覆盖肠端。神经环位于中食道球后21／μm～35μm处。排泄孔位于距虫体前端90μm～110μm处。半月体位于排泄孔前3μm～6 体长／mm体宽／μm口针长／μmabCv卵长／μm雌虫O．9(O．7～1.1)19(15～22)9或1050(47～58)7.O20(15～23)70～80(80～88)×(16～22)雄虫0.6～1.114～199或104436～47718～23 注：a=体长÷最大体宽；b=体长÷自头顶至食道与肠连接处的长度；c=体长÷尾长；V=头顶至阴门处长度×lOO÷体长。μm处。阴门斜裂，其长度为阴门处体宽的二分之一。后阴子宫囊为阴门处体宽的二倍～2.5倍或为阴肛距的50％～67％。尾圆锥形；长为肛门处体宽的5.2倍～5.4倍，末端有一尾尖突。 雄虫：雄虫形态与雌虫相似。交合伞窄，始于交合刺先端水平，延伸至近尾端。交合刺向腹面弯曲，引带短，交合刺长16pm～21／μm。8结果判定 符合第7章形态鉴定特征的可鉴定为水稻茎线虫。9样品保存9.1若鉴定为水稻茎线虫，则需将剩余的线虫杀死、固定制成永久玻片保存；也可以固定后置于含TAF液的指形管内，在4℃冰箱内长期保存，并标上样品编号、制作时间、制作人等。9.2已检出水稻茎线虫的稻种、稻草及稻草编织品等经登记后，要保存在低温干燥、防鼠防虫处，并标明相应基本情况，如样品编号、截获日期、截获人、寄主名称、运输工具名称、输出国名等，样品需至少保存六个月，以备复验、谈判和仲裁。附 录A(资料性附录)水稻茎线虫的寄主与分布A.1水稻茎线虫的寄主 水稻茎线虫是一种专性外寄生线虫，除寄生为害水稻外，还为害稻属的Oryzaalta、O.cubensis、O.eichingeri、O.globerrima、O.1atfolia、O.meyriana、O.minuta、O．nivara、O.officinalis、O.perennis、O.rufipogon、O.spontanea；此外，马达加斯加和缅甸有寄生假稻的报道；越南报道Echinochloacolona和Sacciolepisinterrupta也是此线虫的寄主；Vuong(1969)、Plowrichrt(1992)报道，水稻茎线虫可取食多种真菌，并能繁殖，如链格孢菌和灰葡萄孢菌。A.2水稻茎线虫的分布 水稻茎线虫分布于亚洲和非洲的生长水稻的地区，包括印度、越南、孟加拉、巴基斯但、泰国、缅甸、印度尼西亚、马来西亚、以色列、菲律宾、乌兹别克、埃及、苏丹、马达加斯加、南非、阿联酋等。附 录B(规范性附录)水稻茎线虫的漏斗分离法 首先将10cm～15cm直径的漏斗固定在支架上(图B．1)，柄端接一段乳胶管，管的近末端用止水夹夹紧。将分离的样品先剪成小块，用纱布包好，放入漏斗，加水淹没。分离土壤中的线虫，在漏斗内加一只不锈钢或塑料的网，将纱布铺在筛网上，再放土样。由于线虫有趋水性和自身的重量，线虫不断脱离植物组织，穿过纱布迁游到水中，最后沉降到漏斗末端的乳胶管下端水中。24h后，小心地打开乳胶管末的止水夹，用小培养皿接取约5mL的含有线虫的水样，放在体视显微镜下进行观察。用此法分离线虫时，室内温度最好要保持在25℃左右，温度太高或太低均会影响水稻茎线虫的分离效果。附 录 C(规范性附录)水稻茎线虫玻片标本制作方法c.1线虫的杀死：在体视显微镜下用线虫挑针挑取少量线虫放至凹玻片上的水滴中，使线虫位于水滴中央，手持凹玻片在酒精灯火焰上来回5s～6s，使线虫恰好被杀死为止；杀死大量的线虫，可将线虫悬浮液放在试管中加等量的沸水杀死线虫。C.2线虫的固定：少量线虫被杀死后，可用线虫挑针将线虫移至TAF固定液中固定。大量的线虫被杀死后，在线虫悬浮液中加等量浓度双倍的固定液即可。c.3临时玻片标本的制作：以TAF作为浮载剂，滴适量于载玻片上，用挑针将固定好的线虫移数条于浮载剂中，并使其完全沉下，浮载剂边缘均匀放置3mm～5mm长、直径与线虫体宽相近的玻璃纤维丝三根，加盖玻片，用滤纸吸去溢出的浮载剂，用指甲油封片，待指甲油干后再加封一次，可保存几天至数周。C.4永久玻片标本的制作C.4.1脱水：采用乳酚油快速脱水法(Franklin&Goodey，1949)，把滴有乳酚油的凹玻片放在加热板上，加热至65l℃～70℃，将已固定1d以上的线虫挑入热的乳酚油中，继续加热2min～3min后，在解剖镜下观察标本是否清晰，若不够清晰，继续在65℃～70℃的加热板上加热片刻至清晰(注意避免加热过度而损坏标本)，然后放在干燥器中12h～24h，进一步去除水分后即可制片。C.4.2制片：将直径1.5cm的打孔器在酒精灯火焰上加热后，插到蜡盘中蘸取少量石蜡，并迅速轻按于载玻片中央。待冷却后即形成一个蜡圈。在蜡圈内滴一小滴乳酚油(用量以盖上盖玻片后不外溢为宜)作为浮载剂，将已脱水的线虫数条挑入其中，排列整齐，并使其完全沉下，将与线虫体宽相近的三根3mm～5mm的玻璃纤维丝均匀置于浮载剂边缘，加盖玻片后，将载玻片移至65℃～70℃的加热板上熔蜡，待蜡熔化后移至实验台上冷却，用指甲油封片，待指甲油干后再封一次。最后贴上标签，左边的标签写明样品号、寄主、截获口岸、产地、制作日期；右边的标签写线虫种名、线虫虫态及其数量。