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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准!!#!##$!代替!!#$%&&’%%’#!!#$%&(’%%’#!!#$%(%’%%’#!!#$)(*’%%*#!!#$+’+’%%+布氏杆菌检疫技术规范$%&’&()*(+,’-)-.-/0-’!#$%&&’()($!1!!1!发布$!!1%1!实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书目 次前言Ⅰ…………………………………………………………………………………………………………１ 范围１………………………………………………………………………………………………………２ 规范性引用文件１…………………………………………………………………………………………３ 概述１………………………………………………………………………………………………………４ 临床症状与病理变化１……………………………………………………………………………………５ 病原鉴定１………………………………………………………………………………………………… ５．１ 显微镜检查１………………………………………………………………………………………… ５．２ 细菌培养２…………………………………………………………………………………………… ５．３ 聚合酶链反应（ＰＣＲ）３………………………………………………………………………………６ 血清学检验５……………………………………………………………………………………………… ６．１ 虎红平板凝集试验５………………………………………………………………………………… ６．２ 缓冲平板凝集试验６………………………………………………………………………………… ６．３ 试管凝集试验７……………………………………………………………………………………… ６．４ 补体结合试验９……………………………………………………………………………………… ６．５ 酶联免疫吸附试验１６………………………………………………………………………………… ６．６ 荧光偏振试验１７……………………………………………………………………………………… ６．７ 全乳环状试验１８………………………………………………………………………………………７ 综合判定１８…………………………………………………………………………………………………附录Ａ（资料性附录） 概述１９………………………………………………………………………………附录Ｂ（资料性附录） 临床症状与病理变化２０……………………………………………………………附录Ｃ（规范性附录） 试剂的配制２１………………………………………………………………………附录Ｄ（资料性附录） 国际凝集单位２５……………………………………………………………………附录Ｅ（资料性附录） 溶血素效价的测定２６………………………………………………………………附录Ｆ（资料性附录） 补体效价的计算２７…………………………………………………………………附录Ｇ（资料性附录） 抗原效价的测定２８…………………………………………………………………附录Ｈ（资料性附录） 国际补体结合单位２９………………………………………………………………附录Ｉ（资料性附录） 溶血素效价的确定３０………………………………………………………………附录Ｊ（资料性附录） 补体效价的确定３１…………………………………………………………………附录Ｋ（规范性附录） 抗原效价的测定表３２………………………………………………………………附录Ｌ（规范性附录） 标准溶血孔的配制３３………………………………………………………………附录Ｍ（资料性附录） 间接酶联免疫吸附试验３４…………………………………………………………附录Ｎ（资料性附录） 竞争酶联免疫吸附试验３７…………………………………………………………犛犖／犜１０８８—２０１０前 言 本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准代替ＳＮ／Ｔ１０８８—２００２《布氏杆菌病平板凝集试验操作规程》、ＳＮ／Ｔ１０９０—２００２《布氏杆菌病试管凝集试验操作规程》、ＳＮ／Ｔ１０８９—２００２《布氏杆菌病补体结合试验操作规程》、ＳＮ／Ｔ１３９４—２００４《布氏杆菌病全乳环状试验方法》、ＳＮ／Ｔ１５２５—２００５《布氏杆菌病微量补体结合试验方法》。本标准除编辑性修改外，主要技术变化如下：———增加了布氏杆菌显微镜检查；———增加了细菌培养；———增加了聚合酶链反应；———增加了缓冲平板凝集试验；———增加了酶联免疫吸附试验；———增加了荧光偏振试验。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本标准主要起草人：王玉玲、刘培、朱世强、侯艳梅、栾慎顺。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ／Ｔ１０８８—２００２；———ＳＮ／Ｔ１０９０—２００２；———ＳＮ／Ｔ１０８９—２００２；———ＳＮ／Ｔ１３９４—２００４；———ＳＮ／Ｔ１５２５—２００５。Ⅰ犛犖／犜１０８８—２０１０布氏杆菌检疫技术规范１ 范围本标准规定了布氏杆菌显微镜检查、细菌培养、聚合酶链反应、虎红平板凝集试验、缓冲平板凝集试验、试管凝集试验、补体结合试验、酶联免疫吸附试验、荧光偏振试验、全乳环状试验等技术要求。本标准适用于牛种、猪种布氏杆菌病的检疫。２ 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法ＳＮ／Ｔ１９４２．１ 进出口动物源性食品中布鲁氏菌属检验方法 第１部分：分离与记数方法３ 概述参见附录Ａ。４ 临床症状与病理变化参见附录Ｂ。５ 病原鉴定５．１ 显微镜检查５．１．１ 试剂结晶紫染色液、革兰氏碘液、沙黄复染液、石炭酸复红液、３％盐酸酒精、碱性美蓝染色液，配制方法见附录Ｃ。５．１．２ 主要设备显微镜。５．１．３ 试验程序５．１．３．１ 样品采集取适量待检组织或液体样品，盛于小瓶中送检。５．１．３．２ 样品处理取适量待检样加蒸馏水混匀，用４层纱布过滤，将滤液５０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，用沉淀涂片；也可１犛犖／犜１０８８—２０１０将液体样品直接涂片。５．１．３．３ 革兰氏染色将涂片在酒精灯火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染１ｍｉｎ，水洗。滴加革兰氏碘液，作用１ｍｉｎ，水洗。滴加９５％乙醇脱色，约３０ｓ；或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色１０ｓ。水洗，滴加沙黄复染液，复染１ｍｉｎ。水洗，风干，镜检。５．１．３．４ 萋尼氏染色将涂片在酒精灯火焰上固定，以其背面在酒精灯火焰上来回通过数次，略作加热，但不能太热，以不烫手背为度进行固定。将涂片放在染色架上，滴满石炭酸复红液，用酒精灯在玻片下加热５ｍｉｎ，以冒蒸气而不沸腾为度，稍冷，倾去染色液。加３％盐酸酒精脱色至玻片无红色，约为３０ｓ～６０ｓ。水洗，滴加碱性美蓝液，染色２ｍｉｎ。水洗，风干，镜检。５．１．３．５ 结果判定布氏杆菌革兰氏染色菌体染成红色，为革兰氏阴性菌，一般不发生两级着染。布氏杆菌萋尼氏染色菌体染成红色，背景为蓝色。若发现革兰氏染色阴性、萋尼氏染色为红色的球状杆菌或短小杆菌，可作出疑似布氏杆菌阳性诊断，否则判为显微镜检查阴性。５．２ 细菌培养５．２．１ 试剂布氏肉汤、布氏琼脂、胰化酪蛋白大豆胨琼脂（ＴＳＡ）、血琼脂、ＧＣ培养基、Ｆａｒｒｅｌｌ氏培养基、改良ＴｈａｙｅｒＭａｒｔｉｎ培养基、双向选择Ｃａｓｔａｎｅｄａ氏培养基，配制方法见附录Ｃ。５．２．２ 主要设备普通显微镜、磁力搅拌器、微需氧培养箱。５．２．３ 试验程序５．２．３．１ 样品采集和处理以细菌培养诊断动物布氏杆菌病时，样品的选择应以观察到的临床症状为依据。最有用的样品包括流产的胎儿（胃内容物、脾、肺）、胎膜、阴道分泌物（阴道冲洗物）、奶、精液、关节炎和水囊瘤液。死后采集样品的首选组织为网状内皮组织（如：头、乳腺和生殖器淋巴结及脾）、怀孕后期或生产后早期的子宫、乳房。通常２ｄ～３ｄ即可见有菌落生长，如无细菌生长也要培养８ｄ～１０ｄ才能认为是阴性而弃去。组织：样品采集应选用无菌器具，并用胃消化液把组织浸软或加入少量无菌ＰＢＳ进行研磨后接种到固体培养基。阴道排泄物：采集流产或分娩后的阴道棉拭子，将棉拭子划线接种固体培养基，是分离布氏杆菌的最好途径，其对人的危险性要比流产物小的多。奶：将整个乳房清洗擦干并对奶头进行消毒后采集奶样。奶样采集需全面，每个奶头都需采集１０ｍＬ～２０ｍＬ的奶。第一把奶弃去，将样品直接挤入无菌容器中。注意不要使手与奶接触。将奶样在密封离心管（避免气溶胶污染）中１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，其中的奶油和沉淀混合或分别涂布选择性培养基。如果大体积奶样中出现布氏杆菌，它们的数量一般是比较少的，从这样的样品中分离出布氏杆菌的可能性较小。２犛犖／犜１０８８—２０１０乳制品：乳制品（如：奶酪），也可用以上介绍过的培养基进行培养，但这类样品通常含菌量较少，应先进行增菌培养。用适量的无菌ＰＢＳ为介质，用组织研磨机或浸泡捣碎或电动搅拌机对样品进行均质。产品的上层（外壳及内部）和中心部分都需进行培养。布氏杆菌存活或消失都非常快，它们在产品不同部位的分布与特殊加工工艺造成的物理化学条件有关。所有样品采集后应冷藏并立即用最快的方式运送到实验室。送到实验室时，奶和组织样品如不马上分离应冷冻保存。除非绝对必需，尽量避免使用试验动物。特别是污染严重或含菌量少的组织样品，除非这是能够提供的唯一检测布氏杆菌存在的方法。５．２．３．２ 样品的培养依据不同的样品，可选择下列方法之一进行样品培养：ａ） 直接接种选择性固体培养基组织和阴道排泄物经采集与处理直接接种到选择性固体培养基上。最常用的选择培养基是Ｆａｒｒｅｌｌ氏培养基。由于Ｆａｒｒｅｌｌ氏培养基中的萘啶酸、杆菌肽的浓度可抑制某些羊种布氏杆菌的生长，所以应用改良ＴｈａｙｅｒＭａｒｔｉｎ培养基可提高羊种布氏杆菌的检出。为了促进某些布氏杆菌菌株的生长，可以在基础培养基（如：血琼脂）中加入血清，如加入２％～５％的牛或马血清是牛种布氏杆菌２型生长所必需的。将研磨后的组织和阴道排泄物用棉拭子划线接种到固体培养基上，置微需氧培养箱（５％氧气、１０％二氧化碳和８５％氮气）３６℃±１℃培养３ｄ，取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和生化试验。ｂ） 增菌后接种选择性培养基乳、初乳和某些组织样品中的布氏杆菌数目可能会比流产物中少，因而建议进行增菌培养。对于乳、初乳样品可通过离心，取奶油和离心沉淀进行增菌培养。组织样品可直接进行增菌培养。取２５ｇ处理好的样品加入到２２５ｍＬ的布氏肉汤（含两性霉素Ｂ终浓度１μｇ／ｍＬ和万古霉素终浓度２０μｇ／ｍＬ）中。置微需氧培养箱（５％氧气、１０％二氧化碳和８５％氮气）３６℃±１℃培养６周，每周在固体选择性培养基上作继代培养。分离牛奶中布氏杆菌建议使用双向选择Ｃａｓｔａｎｅｄａ氏培养基，以减少继代培养次数，Ｃａｓｔａｎｅｄａ培养瓶内ＣＯ２浓度应为５％～１０％，３６℃±１℃孵育，每４８ｈ观察有无细菌生长，无菌生长应将培养瓶倾斜，使肉汤流过琼脂表面。无菌生长应将培养瓶延长培养３０ｄ后丢弃。５．２．３．３ 培养物的形态观察在选择性培养基上，２ｄ后就可见布氏杆菌菌落的出现。４ｄ后可见菌落呈圆形，直径１ｍｍ～２ｍｍ，边缘光滑。透射光下，菌落呈浅黄色有光泽，半透明。从上面看，菌落微隆起，灰白色。随时间推移，菌落变大，颜色变暗。在血琼脂上形成微小、灰色不溶血菌落。光滑型（Ｓ）布氏杆菌在培养特别是继代培养时易发生变异而形成粗糙型（Ｒ），菌落透明度降低，边缘粗糙、表面干燥，在折射光下呈暗白或黄色。５．２．３．４ 结果判定对具有布氏杆菌形态的菌落进行革兰氏染色和萋氏染色。革兰氏染色为阴性，萋氏染色为红色的菌应进行生化试验（见ＳＮ／Ｔ１９４２．１）。生化试验结果与布氏杆菌生化特性符合时，判定为布氏杆菌细菌培养阳性；否则，判定为