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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１０８４—２０１０代替ＳＮ／Ｔ１０８４—２００２，ＳＮ／Ｔ１０８５—２００２，ＳＮ／Ｔ１４７２—２００４，ＳＮ／Ｔ１９０７—２００７和ＳＮ／Ｔ２０３６—２００７牛副结核病检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉狆犪狉犪狋狌犫犲狉犮狌犾狅狊犻狊狅犳犫狅狏犻狀犲２０１０１１０１发布２０１１０５０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 本标准代替了ＳＮ／Ｔ１０８４—２００２《副结核皮内变态反应操作规程》、ＳＮ／Ｔ１０８５—２００２《副结核补体结合试验操作规程》、ＳＮ／Ｔ１４７２—２００４《副结核细菌学检查操作规程》、ＳＮ／Ｔ１９０７—２００７《副结核分枝杆菌ＰＣＲ检测技术操作规程》和ＳＮ／Ｔ２０３６—２００７《牛副结核病酶联免疫吸附试验操作规程》。本标准与ＳＮ／Ｔ１０８４—２００２、ＳＮ／Ｔ１０８５—２００２、ＳＮ／Ｔ１４７２—２００４、ＳＮ／Ｔ１９０７—２００７和ＳＮ／Ｔ２０３６—２００７相比，主要技术变化如下：———参考ＯＩＥ《陆生动物诊断试验和疫苗手册（哺乳动物、禽鸟与蜜蜂）》２０１０年版２．１．１１节副结核病（Ｊｏｈｎｅ’ｓ病）中Ｂ部分的诊断技术；———增添了临床诊断、显微镜检查、琼脂免疫扩散试验、酶联免疫吸附试验、探针捕获ＰＣＲ方法、嵌套式ＰＣＲ方法。本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国吉林出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国山西出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检检验疫局、中华人民共和国沈阳出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人：王伟利、姜焱、石建平、巩红霞、孟庆峰、霍蕾、王玉玲、肖成蕊、林颖、孟日增、刘和平、罗雁非、柏亚铎、宋战昀、廉慧锋、董志珍、侯艳梅。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ／Ｔ１０８４—２００２；———ＳＮ／Ｔ１０８５—２００２；———ＳＮ／Ｔ１４７２—２００４；———ＳＮ／Ｔ１９０７—２００７；———ＳＮ／Ｔ２０３６—２００７。Ⅰ犛犖／犜１０８４—２０１０牛副结核病检疫技术规范１ 范围本标准规定了牛副结核病的检疫技术规范。本标准适用于牛的副结核病病原和抗体的检验检疫以及牛副结核病的流行病学调查。２ 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法３ 临床诊断３．１ 总则副结核病（Ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，Ｊｏｈｎｅ’ｓｄｉｓｅａｓｅ）是由副结核分枝杆菌引起的反刍兽的慢性肠炎。根据该病的流行病学、临床症状和病理变化，可以作出初步诊断，但确诊需要通过实验室诊断。３．２ 流行病学副结核分枝杆菌主要感染牛，特别是幼年牛更易感染发病。除牛外，绵羊、山羊、骆驼、猪、马、驴、鹿等动物也可感染。但因潜伏期长，可达６个月～１２个月，甚至更长。有时幼年牛感染直到２岁～５岁时才表现临床症状，在１岁～２岁以后的任何年龄的牛均可发生本病，特别当牛怀孕、分娩或泌乳时易出现症状。病牛和隐性感染牛是传染源，它们可通过乳汁、粪便和尿排出大量病原菌。本病常呈散发或地方性流行，主要经消化道感染，也可通过子宫感染胎儿。该病的流行特点是发展缓慢，发病率不高，病死率高，感染牛群的死亡率可达２％～１０％，甚至可达２５％。３．３ 临床症状发病初期没有明显症状，以后症状逐渐明显，开始是间歇性腹泻，其后逐渐严重和频繁，重者粪便如水样，喷射状排出或稀粥样，含有蛋白凝块、气泡和多量黏液，偶见血丝。早期精神、食欲、泌乳无明显改变，以后食欲减退，精神不佳，泌乳减少或停止。患畜逐渐消瘦，体力不支，经常卧地。被毛粗乱，下颌及肉垂水肿。但体温常无变化。随腹泻症状的延续，则出现进行性的消瘦，直至死亡。３．４ 病理变化早期病变发生在小肠壁和肠系膜淋巴结导管，随着病程进一步发展，在回肠、空肠、小肠后段、盲肠和结肠，以及肠系膜淋巴结出现肉眼可见病变。副结核病不能只根据对肠壁增厚的表面观察而作出诊断，对粘膜层尤其是回肠末端的粘膜，应作病理性增厚和皱褶病变检查，将肠壁拿到明亮处，看到分散的斑块时，即为感染早期的病变。将样品固定（１０％福尔马林）后进一步做组织学检查，样品切片经苏木紫伊红及萋尼氏染色后检查，病理诊断性病变包括粘膜固有层浸润，淋巴集结和肠系膜淋巴结皮质有大的淡染上皮样细胞和多核朗罕氏巨细胞浸润，在这两种细胞中有成丛的或单个的抗酸染色菌存在。１犛犖／犜１０８４—２０１０副结核分枝杆菌开始在病灶中出现，最后遍布全身。４ 显微镜检查４．１ 设备、材料与试剂４．１．１ 设备显微镜、离心机、水浴槽。４．１．２ 材料载玻片。４．１．３ 试剂萋尼氏染色试剂：配制及染色方法见Ａ．１，０．５％氢氧化钠溶液。实验用水应符合ＧＢ／Ｔ６６８２规定。４．２ 操作方法取待检粪样（尽可能取带有粘液或血丝的粪便）１５ｇ～２０ｇ加入约３倍量的０．５％氢氧化钠溶液，混匀，５５℃水浴乳化３０ｍｉｎ，用纱布网过滤，取滤液１０００ｒ／ｍｉｎ，离心５ｍｉｎ，去沉渣后，再以３０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｍｉｎ，弃上清液，用沉淀涂片，也可以取直肠刮取物、病变肠段粘膜直接涂片。火焰固定，进行萋尼氏染色、镜检。４．３ 结果判定发现在细胞内有被染成红色、成丛、成团的抗酸小杆菌（≥３个）即为细菌检查阳性，否则判为细菌检查阴性。５ 细菌学检查５．１ 设备、材料和试剂５．１．１ 设备显微镜、离心机、水浴恒温培养箱、磁力搅拌器。５．１．２ 材料载玻片、刮匙。５．１．３ 试剂５．１．３．１ 脂肪酶（１８００ＩＵ／ｍｇ）。５．１．３．２ 草酸孔雀绿混合液（见Ａ．２）。５．１．３．３ 两性霉素Ｂ、新霉素混合液（见Ａ．３）。５．１．３．４ Ｈｅｒｒｏｌｄ’ｓ培养基（见Ａ．４），改良的Ｄｕｂｏｓ培养基（见Ａ．５）。５．１．３．５ ０．７５％氯化十六烷基吡啶（ＨＰＣ）、０．５％胰蛋白酶水溶液、４％氢氧化钠、７５％酒精。２犛犖／犜１０８４—２０１０５．２ 采样、送检和处理５．２．１ 采样５．２．１．１ 乳汁常乳在分娩后１４ｄ～２５ｄ内收集。取乳样前，乳头用７５％的酒精擦洗消毒，弃去前几把始乳后，收集乳样２００ｍＬ于无菌的容器里。５．２．１．２ 粪便选取混有血液、粘膜的粪便或使用刮匙从动物直肠深部（约３０ｃｍ）取少量粘液粪便，盛于灭菌容器内，也可将上述材料直接涂片，干燥，镜检。５．２．１．３ 肠段和淋巴结选取有明显病变的肠段、回盲瓣、肠系膜淋巴结以及其他出现病理变化的区域。５．２．２ 样品处理５．２．２．１ 乳汁的处理取乳样１００ｍＬ加２ｍｇ脂肪酶３７℃消化２ｈ～３ｈ，再加入等量的草酸、孔雀绿混合液充分混匀，３７℃水浴中放置３０ｍｉｎ，去除杂菌，并不时的振摇，５０００ｒ／ｍｉｎ，离心３０ｍｉｎ，弃上清液，取沉淀物接种于Ｈｅｒｒｏｌｄ’ｓ培养基或改良的Ｄｕｂｏｓ培养基。同时制成涂片，进行萋尼氏法染色、镜检。５．２．２．２ 粪便的处理将１ｇ粪便放入盛２０ｍＬ蒸馏水的试管中，室温振荡３０ｍｉｎ，静止３０ｍｉｎ。取５ｍＬ上层悬浮液到盛２０ｍＬ含０．７５％ＨＰＣ的试管中。颠倒混匀，室温静置１８ｈ，取试管底部沉淀作为待检物。５．２．２．３ 肠段和淋巴结的处理肠段：刮取约４ｇ粘膜；淋巴结：剔除外部脂肪后称取４ｇ。放入盛５０ｍＬ胰蛋白酶容器中，用４％的氢氧化钠溶液调ｐＨ至７．２，室温下磁力搅拌器搅拌３０ｍｉｎ。消化后的混合物用纱布过滤，滤液以２０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｍｉｎ，弃去上清液。将沉淀用２０ｍＬ含０．７５％的ＨＰＣ重新悬浮，室温下静置１８ｈ，试管底部沉淀为待检物。５．３ 样品的培养取３只含分枝杆菌素的Ｈｅｒｒｏｌｄ’ｓ培养基（或改良的Ｄｕｂｏｓ培养基斜面）和１只不含分枝杆菌素的Ｈｅｒｒｏｌｄ’ｓ培养基斜面，分别接种０．１ｍＬ上述任一种处理过的待检物，接种物要均匀地接种到斜面上，将试管螺帽拧松后在３７℃下按斜面角度放置７ｄ。当水分从斜面上蒸发以后，将试管螺帽拧紧后垂直放置于３７℃温箱中。每周观察斜面一次，连续观察１５周～２０周。５．４ 培养物的形态观察副结核分枝杆菌的初代培养会出现在接种后５周～１４周内，在含有分枝杆菌素的Ｈｅｒｒｏｄ’ｓ培养基上副结核分枝杆菌的初始菌落很小（直径１ｍｍ），无色、半透明、半球状、边缘整齐、表面光滑、有光３犛犖／犜１０８４—２０１０泽，随培养时间延长，菌落变大（４ｍｍ～５ｍｍ），不透明，菌落的形态从光滑变为粗糙，从半球状变为乳头状。５．５ 样品的镜检将上述沉淀物涂片作萋尼氏抗酸染色，镜检可见到红色成丛、成堆排列（３个以上）杆菌，视野中背景为蓝色。如一张标本能检出抗酸性杆菌的团块，则可怀疑为本病。５．６ 结果判定如在含分枝杆菌素的Ｈｅｒｒｏｌｄ’ｓ培养基或含分支杆菌素的改良Ｄｕｂｏｓ培养基上有菌生长，而在不含分枝杆菌素的培养基上无菌生长，镜检为抗酸染色阳性的红色成丛小杆菌，并出菌时间较长（３周～３个月）时，即认为是副结核分枝杆菌。６ 皮内变态反应试验（迟发型过敏反应，犇犜犎）６．１ 材料与试剂６．１．１ 材料１ｍＬ注射器，适配针头（４号～５１／２号），游标卡尺、７０％酒精棉球。６．１．２ 试剂灭菌生理盐水，副结核分枝杆菌提纯蛋白衍生物（副结核ＰＰＤ）或禽分枝杆菌提纯蛋白衍生物（禽结核ＰＰＤ），使用前用生理盐水稀释使其最终浓度为０．５ｍｇ／ｍＬ。由指定单位提供。６．２ 操作步骤（两种接种途径）６．２．１ 颈部接种将颈部（左侧或右侧）中三分之一处将毛剪净，剪毛区直径约１０ｃｍ。将接种部位皮肤捏起，用卡尺测量捏褶皮肤的厚度，并做记录，皮厚单位用毫米（ｍｍ）表示。用酒精棉球消毒接种部位，用注射器吸取０．１ｍＬ副结核菌素，与接种部位呈１５°～２０°的角度进行皮内注射，注射部位应出现鼓包或隆起，若无小鼓包则应在另侧颈部相应部位再注射一次。如果注至皮下或溢出，应于离注射点８ｃｍ以外补注一针，并在记录中加以说明。６．２．２ 尾根部接种将尾巴托起，在尾根（左侧或右侧）无毛的皱褶部进行皮内注射。接种方式同６．２．１。６．３ 判定结果６．３．１ 在接种后分别于４８ｈ、７２ｈ检查注射部位有无热、肿、痛等炎性反应，并以卡尺测量接种部位捏褶皮肤厚度。６．３．２ 颈部：接种后于７２ｈ皮肤厚度减去接种前皮肤厚度，皮厚增加２ｍｍ以上时，迟发型变态反应阳性，皮厚差≤２ｍｍ为阴性。６．３．３ 尾根部：在接种后分别于４８ｈ、７２ｈ观察并触摸接种部位，７２ｈ进行终判，肿胀者为阳性，无肿胀者为阴性。４犛犖／犜１０８４—２０１０７ 聚合酶链（犘犆犚）反应（之一）７．１ 设备、材料和试剂７．１．１ 设备ＰＣＲ扩增仪、高速冷冻离心机、超净工作台、旋涡振荡器、凝胶成像分析系统、恒温水浴振荡器、磁力搅拌器、天平、消毒灭菌锅、高温干燥箱、冰箱。７．１．２ 材料可调微量移液器（２００μＬ～１０００μＬ、２０μＬ～２００μＬ、２μＬ～２０μＬ、０．５μＬ～１０μＬ）、１．５ｍＬ、０．２ｍＬ离心管和吸头（用ＤＥＰＣ水处理后高压灭菌备用）。７．１．３ 试剂７．１．３．１ ＰＢＳ缓冲液（ｐＨ７．４）、ＴＥ缓冲液、溶菌酶、ＳＤＳ、蛋白酶Ｋ、ＳＤＳ／蛋白酶Ｋ、ＣＴＡＢ／ＮａＣｌ（见Ａ．６～Ａ．１２）。７．１．３．２ 三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙醇。７．１．３．３ ＴＡＥ电泳缓冲液、１％琼脂糖凝胶、１０ｍｇ／ｍＬ溴化乙锭溶液（见Ａ．１３～Ａ．１５）。７．２ 操作步骤７．２．１ 样品的制备７．２．１．１ 标准菌株副结核分枝杆菌由国家指定单位提供。７．２．１．２ 粪便称取新鲜粪便１ｇ，加３ｍＬＰＢＳ，混匀，放置３０ｍｉｎ或３００ｒ／ｍｉｎ室温离心５ｍｉｎ，取上清液，室温放置３０ｍｉｎ或３００ｒ／ｍｉｎ室温再次离心５ｍｉｎ，取上清液，１２０００ｒ／ｍｉｎ室温离心１５ｍｉｎ，弃上清液，加入４００μＬＴＥ。７．２．１．３ 奶样无菌操作取