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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准!!#!#$%!&!代替!!#$%&’($$$进出口肉#肉制品及其他食品中肠出血性大肠杆菌$&’#$%#检测方法&’(’)*+,-(+.,./’,(’).01’*.))1-2+3!)#$%$&’#$%#+,*’-(4!*’-(5).673(-,6.(1’)/..6/.)+*5.)(-,6’85.)(%!&!0&&0!&发布%!&&0!’0!&实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布食品伙伴网书书书前 言 本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准代替ＳＮ／Ｔ０９７３—２０００《进出口肉及肉制品中肠出血性大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７检测方法》。本标准与ＳＮ／Ｔ０９７３—２０００相比，主要技术变化如下：———补充了ＥＬＩＳＡ方法快速检测肠出血性大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７的内容；———补充了微生物遗传分子特征性鉴定技术（基因分型）内容，便于对该危害性致病菌的溯源性调查和变异性研究。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、３Ｍ中国有限公司、生物梅里埃（中国）公司。本标准主要起草人：张树宏、顾鸣、韩伟、杨捷琳、范放、吕敬章、万志刚、吕雷、朱贻华、刘毅。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ／Ｔ０９７３—２０００。Ⅰ犛犖／犜０９７３—２０１０食品伙伴网进出口肉、肉制品及其他食品中肠出血性大肠杆菌犗１５７：犎７检测方法１ 范围本标准规定了进出口肉及肉制品中肠出血性大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７的检测方法。本标准适用于进出口肉、肉制品及其他食品中的肠出血性大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７的定性检验。２ 定义和术语下列术语和定义适用于本文件。２．１肠出血性大肠杆菌犗１５７：犎７ 犲狀狋犲狉狅犺犲犿狅狉狉犺犪犵犻犮犈．犆狅犾犻犗１５７：犎７本细菌为需氧或兼性厌氧、革兰氏阴性，有周鞭毛，并有菌毛，不产生芽孢，发酵乳糖，不发酵或迟缓发酵山梨醇，氧化酶阴性，β葡萄糖苷酶阴性的杆菌。３ 方法原理采用Ｔｅｃｒａ微孔板法大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７快速检测试剂盒方法１）。样品增菌液煮沸裂解，裂解液与特异性抗体（一抗）包被的微孔板杂交后，用酶标抗体（二抗）再杂交，然后与特定底物反应生成有色化合物，利用肉眼或酶标仪进行检测。４ 设备和材料４．１ 恒温培养箱：（１０℃～５０℃）±１℃。４．２ 均质器：小于１２０００ｒ／ｍｉｎ。４．３ 高压灭菌锅。４．４ 科玛嘉大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７显色琼脂平板２）。４．５ ＶＩＤＡＳ自动酶联免疫检测仪，法国梅利埃公司产品或其他等效产品３）。４．６ ＶＩＴＥＫ自动微生物生化鉴定仪或其他等效产品３）。１）、２） 分别为由美国３Ｍ公司和法国科玛嘉公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。３） 由法国生物梅里埃公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。４．７ 微生物实验室通用玻璃器皿、移液管、玻皿等。４．８ 铂铱或镍铬丝接种环，直径约３ｍｍ；玻璃Ｌ棒。１犛犖／犜０９７３—２０１０食品伙伴网４．９ 电子天平：精确值０．００１ｇ。４．１０ 移液枪及枪头：１ｍＬ、０．２ｍＬ。４．１１ 洗板机。４．１２ 酶标仪（波长４５０ｎｍ）。５ 培养基和试剂除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水（Ｔｅｃｒａ法试剂的配制使用重蒸水）。５．１ 改良Ｅ．Ｃ新生霉素增菌肉汤［ｍ（ＥＣ）ｎ］：见附录Ａ中Ａ．１。５．２ 山梨醇麦康凯琼脂（ＳＭＡＣ）：见附录Ａ中Ａ．２。５．３ 月桂基磷酸盐胰蛋白胨ＭＵＧ肉汤（ＬＳＴＭＵＧ）：见附录Ａ中Ａ．３。５．４ ＴｅｃｒａＴＭ微孔板法大肠杆菌Ｏ１５７快速检测试剂盒、ＶＩＤＡＳ或ＶＩＤＡＳＵＰＯ１５７：Ｈ７测试条或其他等效产品。５．５ 含新生霉素的缓冲胰蛋白胨大豆肉汤（ＢＴＳＢ＋Ｎ）：见附录Ａ中Ａ．４。５．６ Ｉｍｂｅｎｔｉｎ补充液：见附录Ａ中Ａ．５。６ 试样制备与保存６．１ 制备从混合样品中取出代表性样品，将可食用部分（去掉可见脂肪）充分均质。用四分法所分出不少于５００ｇ作为试样，装入灭菌容器内，加封后标明标记。６．２ 保存试样于－１８℃以下冷冻保存。７ 检测流程检测流程见图１。２犛犖／犜０９７３—２０１０食品伙伴网图１ 大肠杆菌犗１５７：犎７的检测流程８ 检测步骤８．１ 常规方法８．１．１ 增菌无菌操作称取６．１的试样２５ｇ放入含２２５ｍＬｍ（ＥＣ）ｎ增菌肉汤的均质容器中，置４１℃±１℃培养１８ｈ～２４ｈ。８．１．２ 分离对８．１．１增菌肉汤进行１０倍递增稀释，从１０－４、１０－５、１０－６稀释液中各取０．１ｍＬ滴加于ＳＭＡＣ平板或（和）科玛嘉大肠杆菌显色琼脂平板上，以灭菌Ｌ棒进行涂布并置于３６℃±１℃培养１８ｈ～２４ｈ。在ＳＭＡＣ平板上可疑ＥＨＥＣ菌落呈淡褐色中心，扁平透明，边缘光滑，直径约２ｍｍ。在科玛嘉大肠杆菌显色琼脂平板上可疑ＥＨＥＣ菌落呈紫红色。８．１．３ 生化试验和血清学鉴定每个ＳＭＡＣ平板或科玛嘉大肠杆菌显色琼脂平板上要求挑选不少于５个～８个可疑菌落，然后将３犛犖／犜０９７３—２０１０食品伙伴网挑出的每个菌落接种到ＬＳＴＭＵＧ肉汤中，３６℃±１℃培养２４ｈ，出现产气，并且无荧光者，于普通营养琼脂进行纯化，并对单菌落参见附录Ｂ进行生化鉴定，或采用ＶＩＴＥＫ或等效的自动微生物生化鉴定仪进行鉴定，然后用Ｏ１５７：Ｈ７标准血清做凝集试验。最后，也可见附录Ｃ采用遗传分子特征性鉴定试验进行鉴定。８．１．４ 结果报告根据选择性分离平板、生化试验和血清学鉴定结果，分别报告２５ｇ样品中检出或未检出肠出血性大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７。８．２ 犜犲犮狉犪犜犕微孔板法大肠杆菌犗１５７：犎７快速检测试剂盒方法８．２．１ 增菌８．２．１．１ 熟肉制品同８．１．１８．２．１．２ 生肉制品无菌操作称取６．１的试样２５ｇ放入含２２５ｍＬｍ（ＥＣ）ｎ增菌肉汤的５００ｍＬ灭菌光口瓶中，然后再添加２．２５ｍＬ的Ｉｍｂｅｎｔｉｎ补充液，置４１℃±１℃培养１８ｈ～２４ｈ。８．２．１．３ 其他食品无菌操作称取６．１的试样２５ｇ放入含２２５ｍＬＢＴＳＢ增菌肉汤的５００ｍＬ灭菌光口瓶中，置４１℃±１℃培养１８ｈ～２４ｈ。８．２．２ 犜犲犮狉犪试剂盒检测８．２．２．１ 检测前，将ＴｅｃｒａＥＬＩＳＡ试剂盒置室温（２０℃～２５℃）１０ｍｉｎ。８．２．２．２ 将前述增菌液样品热处理，添加５０μＬ的样品添加物到合适的试管中，然后再加入１ｍＬ增菌到同一试管内，充分混合。８．２．２．３ 进行热处理，在沸水浴中将试管加热１５ｍｉｎ后，将试管冷却到室温。８．２．２．４ 每个微孔加入２００μＬ的阳性／阴性对照液或２００μＬ热处理过的样品，于３６℃±１℃反应３０ｍｉｎ。吸取每个样品时需换用新的移液器吸头。８．２．２．５ 倾除检测板微孔中的溶液，用洗液充满每个微孔，注意不要将气泡滞留于孔板底部、洗涤检板３次。８．２．２．６ 每个微孔加入２００μＬ的标记结合物，用塑料薄膜封住微孔后，于３６℃±１℃反应３０ｍｉｎ。８．２．２．７ 按８．２．２．５冲洗检测板微孔４次。８．２．２．８ 每个微孔加入２００μＬ的底物，置于室温２０℃～２５℃，放置１５ｍｉｎ。８．２．２．９ 每个微孔添加２０μＬ终止液。轻敲孔板边缘以混合内容物，然后在３０ｍｉｎ内判读结果。８．２．２．１０ 结果可依据试剂盒说明用肉眼判读或用酶标仪判读。酶标仪判读时，阴性对照孔ＯＤ值应＜０．２，阳性对照孔ＯＤ值应＞１．０。如果阳性对照ＯＤ值＜１．０时，需要延长显色时间；３０ｍｉｎ后，如果阳性对照孔ＯＤ值仍然＜１．０，即本次检测结果无效。样品孔ＯＤ值＜０．２时判为阴性，≥０．２时判为阳性。８．２．３ 阳性结果的鉴定出现阳性结果时，在ＳＭＡＣ平板和科玛嘉大肠杆菌显色琼脂平板上对原增菌肉汤进行培养分离，４犛犖／犜０９７３—２０１０食品伙伴网若有可疑菌落生长，依据８．１．３进行鉴定。８．２．４ 结果报告８．２．４．１ 若试剂盒检测结果为阴性，报告２５ｇ样品中未检出肠出血性大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７。８．２．４．２ 若试剂盒检测结果为阳性，则根据分离纯化及生化试验和血清学鉴定结果，分别报告２５ｇ样品中检出或未检出肠出血性大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７。８．３ 犞犐犇犃犛仪器法大肠杆菌犗１５７：犎７的快速筛选检测方法８．３．１ 增菌同８．１．１８．３．２ 自动酶联免疫检测８．３．２．１ 取１ｍＬ增菌液到灭菌小试管中，于沸水中加热１５ｍｉｎ。剩余的菌液于４０℃保存，以便用于阳性确认。８．３．２．２ 取肠出血性大肠埃希氏菌Ｏ１５７：Ｈ７的荧光免疫试剂盒，室温放置至少３０ｍｉｎ，使试剂温度平衡至环境温度。８．３．２．３ 取适量加热处理并冷却后的增菌液到试剂盒测试孔中，通过自动或手动操作免疫反应过程后，检测反应强度（荧光强度或吸光度），与参照值比较，得出检验结果。详细操作需根据所用仪器及试剂盒的说明进行。８．３．３ 阳性结果的鉴定出现阳性结果时，在ＳＭＡＣ平板和科玛嘉大肠杆菌显色琼脂平板上对原增菌肉汤进行分离培养，若有可疑菌落生长，依据８．１．３进行鉴定。８．３．４ 结果报告８．３．４．１ 若ＶＩＤＡＳ检测结果为阴性，报告２５ｇ样品中未检出肠出血性大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７。８．３．４．２ 若ＶＩＤＡＳ检测结果为阳性，则根据分离纯化及生化试验和血清学鉴定结果，分别报告２５ｇ样品中检出或未检出肠出血性大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７。５犛犖／犜０９７３—２０１０食品伙伴网附 录 犃（规范性附录）培养基和试剂犃．１ 改良犈．犆新生霉素增菌肉汤犿（犈犆）狀胰蛋白胨 ２０．０ｇ３号胆盐１．１２ｇ乳糖５．０ｇ无水磷酸氢二钾４．０ｇ无水磷酸二氢钾１．５ｇ氯化钠５．０ｇ水１０００．０ｍＬ将上述成分溶于水后校正ｐＨ至６．９±１，分装后置１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ，取出滤灭菌的新生霉素溶液２０ｍｇ／Ｌ加入，使最终浓度为２０μｇ／Ｌ。犃．２ 山梨醇麦康凯平板（犛犕犃犆）蛋白胨１７．０ｇ月示胨３．０ｇ猪胆盐（或牛、羊胆盐）５．０ｇ氯化钠５．０ｇ琼脂１７．０ｇ水１０００．０ｍＬ山梨醇１０．０ｇ０．０１％结晶紫水溶液１０．０ｍＬ０．５％中性红水溶液５．０ｍＬ１％亚碲酸钾溶液（最终量为）２．５ｍＬ将蛋白胨、月示胨、胆盐和氯化钠溶解于４００ｍＬ蒸馏水中，校正ｐＨ至７．２将琼脂加入于６００ｍＬ蒸馏水中加热溶解，将两液合并，分装于锥形瓶内高压灭菌（１２１℃、１５ｍｉｎ备用）。临用前加热融化琼脂，趁热加入山梨醇，冷却至５０℃～５５℃时加入结晶紫和中性红溶液并加入过滤出８菌的亚碲酸钾溶液，使最终浓度为２．５ｍｇ／Ｌ，并加入头孢克肟（Ｃｅｆｉｘｉｍｅ），使最终浓度为０．０５ｍｇ／Ｌ。犃．３ 月桂基磷酸盐胰蛋白胨（犔犛犜）犕犝犌肉汤（犔犛犜犕犝犌）胰蛋白胨或胰酪胨（Ｔｒｙｔｉｃａｓｅ）２０．０ｇ氯化钠５．０ｇ乳糖５．０ｇ磷酸氢二钾２．７５ｇ磷酸二氢钾２．７５ｇ月桂基磷酸钠０．１ｇ６犛犖／犜０９７３—２０１０食品伙伴网四甲基伞形酮Ｂ葡萄糖醛苷酸（ＭＵＧ）０．１ｇ水１０００．０ｍＬ将上述成分溶解于蒸馏水中，分装到有倒立发酵管的试管中，每管１０ｍＬ，于１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ，最终ｐＨ６．８±０．２。犃．４ 含新生霉素的缓冲胰蛋白胨大豆肉汤（犅犜犛犅＋犖）胰蛋白胨１７ｇ大豆蛋白胨３ｇ磷酸氢二钾４ｇ氯化钠５ｇ葡萄糖２．５ｇ蒸馏水１０００ｍＬ或采用以下配方：胰蛋白胨大豆肉汤（ＴＳ