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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜０１８４．３—２００８进出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测方法第３部分：免疫磁珠法犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犔犻狊狋犲狉犻犪犿狅狀狅犮狔狋狅犵犲狀犲狊犻狀犳狅狅犱犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋—犘犪狉狋３：犐犿犿狌狀狅犿犪犵狀犲狋犻犮犫犲犪犱狊犪狊狊犪狔２００８０９０４发布２００９０３１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 本部分的附录Ａ、附录Ｂ均为规范性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本部分主要起草人：吴斌、李振荣、胡传伟、王玉萍、蒋维旗。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜０１８４．３—２００８进出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测方法第３部分：免疫磁珠法１ 范围ＳＮ／Ｔ０１８４的本部分规定了进出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌取样、制样和免疫磁珠检测方法。本部分适用于进出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验。２ 规范性引用文件下列文件中的条款通过ＳＮ／Ｔ０１８４本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。ＧＢ１９４８９ 实验室生物安全通用要求ＳＮ／Ｔ０１８４．１ 进出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验方法３ 方法概述将直径０．０５μｍ～４μｍ具有磁性的微珠的表面化学修饰，并与李斯特氏菌特异性抗体结合，制成免疫磁珠，它能与食品中李斯特氏菌抗原结合，从而检出食品中的李斯特氏菌。样品经２４ｈ～４８ｈ增菌后，分别取１ｍＬ增菌液和２０μＬ免疫磁珠加入带盖塑料管中，在磁板背景下混合，如果有李斯特氏菌抗原存在，免疫磁珠就会将其捕获，然后利用磁性将免疫磁珠聚集，经清洗后接种到显色培养基和任选一种培养基（ＯＸＡ或ＰＡＬＣＡＭ琼脂），对于选择性分离平板上典型李斯特氏菌菌落进行确认，最终通过系列试验确定是否存在单核细胞增生李斯特氏菌。４ 设备和器具４．１ 培养箱：３７℃±１℃；４１．５℃±１℃。４．２ 水浴锅：４５℃±１℃。４．３ 微量移液器：２０μＬ～２００μＬ，１０μＬ，１ｍＬ。４．４ 刻度移液管：５ｍＬ、１０ｍＬ。４．５ 灭菌玻璃器具：量筒、三角烧瓶、培养皿（直径９０ｍｍ）、试管。４．６ 灭菌管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管）：１．５ｍＬ。４．７ 抗李斯特氏菌免疫磁珠：该磁珠可以通过商业途径获得。应准确地按照生产商的说明书进行操作。４．８ 旋涡混合器。４．９ 带有磁架的磁性分离器。５ 培养基和试剂除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水。５．１ 胰酪大豆肉汤（ＴＳＢＹＥ）：见第Ａ．１章。１犛犖／犜０１８４．３—２００８５．２ 胰酪大豆琼脂（ＴＳＡＹＥ）：见第Ａ．２章。５．３ Ｆｒａｓｅｒ肉汤增菌液（ＦＢ１，ＦＢ２）：见第Ａ．３章。５．４ ＯＸＡ琼脂：见第Ａ．４章。５．５ ＰＡＬＣＡＭ琼脂：见第Ａ．５章。５．６ 显色培养基。注：本部分使用的培养基为ＣＨＲＯＭａｇａｒ公司产品，其他公司的等效显色培养基应验证后使用。５．７ 磷酸盐缓冲溶液（ＰＢＳ）：见第Ａ．６章。５．８ 参考菌株：单核细胞增生李斯特氏菌（ＣＭＣＣ５４００２）。６ 检验步骤６．１ 样品制备在均质袋中加入２５ｇ样品，再加入２２５ｍＬＦＢ１增菌肉汤（见５．３），３０℃培养２４ｈ±１ｈ。６．２ 增菌取１ｍＬ６．１中制备好的样品，加到１０ｍＬＦＢ２增菌液（见５．３）中，３５℃培养２４ｈ±１ｈ后，进行免疫磁珠分离。６．３ 免疫磁珠分离（犐犕犛）６．３．１ 免疫捕获混合６．２增菌培养液，沉淀所有的粗糙食物残渣，从增菌培养液中移取１ｍＬ上层液体（要尽可能避免移取到食物颗粒和脂肪颗粒）加入Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管（见４．６）中，加２０μＬ准备好的免疫磁珠（见４．７）。在旋涡混合器（见４．８）上混合该悬液。６．３．２ 分离将Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管固定在磁架（见４．９）的管孔中，１８０°轻缓摆动磁架５次～６次，使免疫磁珠聚集到磁极。小心地打开磁架上的Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管管盖，从磁极对面一侧慢慢吸出液体，注意不要接触管壁上的磁珠，每一个样品换一次枪头；加１ｍＬ灭菌的ＰＢＳ（见５．７），并重新盖好盖子，将磁极从支架上移走，１８０°轻缓摆动磁架５次～６次，使管内各成分混合，然后重新将磁极放回到支架上。重复该清洗步骤几次。将离心管从磁性分离器上移开，并加１００μＬ灭菌的ＰＢＳ（见５．７）到管中，重悬磁珠。如果实验室没有磁性分离器，也可以用手摇代替。６．４ 分离培养６．４．１ 分离培养吸取５０μＬ免疫磁珠悬液，加到显色培养基（见５．６）及任一选择性培养基ＯＸＡ（见５．４）、ＰＡＬＣＡＭ（见５．５）琼脂平板上，用无菌接种环划线，３５℃±１℃培养２４ｈ～４８ｈ。６．４．２ 筛选李斯特氏菌在ＣＨＲＯＭａｇａｒ显色培养基上菌落为蓝色，且在其周围形成一个晕环。李斯特氏菌在ＯＸＡ琼脂平板上生长２４ｈ后菌落呈现黑色，直径为１ｍｍ，在其周围形成一个黑色环，培养４８ｈ，菌落仍呈黑色，直径２ｍｍ～３ｍｍ，除在菌落周围有一环外，在菌落中心部位的深层也形成黑点。李斯特氏菌在ＰＡＬＣＡＭ琼脂平板上与在ＯＸＡ琼脂平板上菌落相似。在ＣＨＲＯＭａｇａｒ显色培养基及ＯＸＡ或ＰＡＬＣＡＭ琼脂平板上挑取５个或更多可疑菌落，接种于ＴＳＡＹＥ琼脂（见５．２）平板上，纯培养后进鉴定。６．５ 鉴定和确认单核细胞增生李斯特氏菌的鉴定和确认按ＳＮ／Ｔ０１８４．１执行，单核细胞增生李斯特氏菌检验程序图见附录Ｂ。７ 质量控制每次检验均应用单核细胞增生李斯特氏菌（见５．８）进行质量控制。２犛犖／犜０１８４．３—２００８８ 结果判定８．１ 凡通过本方法在被检食品中分离获得的纯菌落，各项生化试验结果均符合ＳＮ／Ｔ０１８４．１所规定的生化特征，报告为在２５ｇ被检食品中检出单核细胞增生李斯特氏菌。８．２ 各项生化试验结果不符合ＳＮ／Ｔ０１８４．１所规定的生化特征，报告为在２５ｇ被检食品中未检出单核细胞增生李斯特氏菌。９ 安全防护单核细胞增生李斯特氏菌为生物安全二级病原微生物。微生物检测实验室的工作人员对该菌进行检验时，应遵守ＧＢ１９４８９中关于实验室生物安全防护的要求。易被其感染的年幼儿童、虚弱者、年长老人、免疫缺陷者应远离单核细胞增生李斯特氏菌分离、鉴定和确认的试验场所。３犛犖／犜０１８４．３—２００８附 录 犃（规范性附录）培养基和试剂犃．１ 胰酪胨大豆肉汤（犜犛犅犢犈）犃．１．１ 成分胰酪蛋白胨（或胰蛋白胨）１７．０ｇ植物蛋白胨３．０ｇ氯化钠５．０ｇ磷酸二氢钾６．５ｇ葡萄糖６．５ｇ酵母浸膏６．０ｇ蒸馏水１０００ｍＬ犃．１．２ 制法将上述各成分加热煮沸溶解冷却后，调ｐＨ至７．１～７．５，分装，１２１℃灭菌１５ｍｉｎ，备用。犃．２ 胰胨大豆琼脂（犜犛犃犢犈）犃．２．１ 成分胰酪蛋白胨（或胰蛋白胨）１５．０ｇ植物蛋白胨５．０ｇ氯化钠５．０ｇ酵母浸膏６．０ｇ琼脂１５．０ｇ蒸馏水１０００ｍＬ犃．２．２ 制法除琼脂外，将其他各成分加热煮沸溶解冷却后，调ｐＨ至７．１～７．５，再加入琼脂，１２１℃灭菌１５ｍｉｎ，备用。犃．３ 犉狉犪狊犲狉肉汤增菌液（犉犅１，犉犅２）犃．３．１ 基础肉汤犃．３．１．１ 基础肉汤成分酪蛋白酶消化物５．０ｇ动物组织酶消化物５．０ｇ牛肉浸膏药５．０ｇ酵母浸膏５．０ｇ氯化钠２０．０ｇ磷酸氢二钠１６．０ｇ磷酸二氢钾１．３５ｇ七叶苷１．０ｇ氯化锂３．０ｇ蒸馏水１０００ｍＬ４犛犖／犜０１８４．３—２００８犃．３．１．２ 制法将上述成分置于５０℃水浴中充分溶解，冷却后调ｐＨ至７．０～７．４，分装，１２１℃灭菌１５ｍｉｎ。犃．３．２ 盐酸吖啶黄溶液盐酸吖啶黄２５ｍｇ灭菌蒸馏水１０ｍＬ 振摇混匀，充分溶解后过滤除菌，避光保存。犃．３．３ 萘啶酮酸钠盐溶液萘啶酮酸２０ｍｇ０．０５ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液１０ｍＬ 振摇混匀，充分溶解后过滤除菌。犃．３．４ ０．０５犿狅犾／犔氢氧化钠溶液氢氧化钠０．１ｇ灭菌蒸馏水５０ｍＬ 振摇混匀，充分溶解。犃．３．５ 柠檬酸铁铵溶液柠檬酸铁铵０．５ｇ灭菌蒸馏水１０ｍＬ 振摇混匀，充分溶解后过滤除菌。犃．３．６ 犉狉犪狊犲狉犿肉汤犉犅１增菌液犃．３．６．１ 犉狉犪狊犲狉犿肉汤犉犅１增菌液成分盐酸吖啶黄溶液５ｍＬ萘啶酮酸钠盐溶液５ｍＬ柠檬酸铁铵溶液１０ｍＬ犃．３．６．２ 制法将Ａ．３．６．１中各成分按上述体积加入到１０００ｍＬＡ．３．１基础肉汤中，无菌分装于１０ｍＬ，大试管中备用。犃．３．７ 犉狉犪狊犲狉犿肉汤犉犅２增菌液犃．３．７．１ 犉狉犪狊犲狉犿肉汤犉犅２增菌液成分盐酸吖啶黄溶液５ｍＬ萘啶酮酸钠盐溶液５ｍＬ犃．３．７．２ 制法将Ａ．３．７．１中各成分按上述体积加入到１０００ｍＬＡ．３．１基础肉汤中，无菌分装于１０ｍＬ大试管中备用。犃．４ 犗犡犃琼脂犃．４．１ 成分蛋白胨２３．０ｇ淀粉１．０ｇ氯化钠５．０ｇ柠檬酸铁铵０．５ｇ七叶苷１．０ｇ氯化锂１５．０ｇ琼脂１３．０ｇ５犛犖／犜０１８４．３—２００８蒸馏水１０００ｍＬ吖啶黄素５．０ｍｇ头孢双硫唑甲氧６．０ｍｇ放线菌酮４００．０ｍｇ硫酸盐粘功菌素２０．０ｍｇ磷霉素１０．０ｍｇ犃．４．２ 制法除吖啶黄素、头孢双硫唑甲氧、放线菌酮、磷霉素、硫酸盐粘菌素和琼脂外，将其他成分加热煮沸溶解冷却后，调ｐＨ至７．０～７．４，再加入琼脂，１２１℃灭菌１５ｍｉｎ，冷却至５０℃，无菌操作，加入用５ｍＬ乙醇和５ｍＬ无菌水溶解的吖啶黄素、头孢双硫唑甲氧、放线菌酮、磷霉素，摇匀，倾注平板。犃．５ 犘犃犔犆犃犕琼脂犃．５．１ 成分蛋白胨２３．０ｇ淀粉１．０ｇ酵母浸膏３．０ｇ氯化钠５．０ｇＤ葡萄糖０．５ｇＤ甘露醇１０．０ｇ柠檬酸铁铵０．５ｇ七叶苷０．８ｇ氯化锂１５．０ｇ酚红０．０８ｇ琼脂１３．０ｇ蒸馏水１０００ｍＬ盐酸吖啶黄素５．０ｍｇ硫酸多粘菌素Ｂ０．０１ｇ复达新２０．０ｍｇ犃．５．２ 制法除盐酸吖啶黄素、硫酸多粘菌素Ｂ、复达新和琼脂外，将其他各成分加热煮沸溶解冷却后，调ｐＨ至７．０～７．４，再加入琼脂，１２１℃灭菌１５ｍｉｎ，冷却至５０℃，无菌操作，加入用适量无菌水溶解的盐酸吖啶黄素、硫酸菌素Ｂ、复达新，摇匀，倾注平板。犃．６ 磷酸盐缓冲溶液（犘犅犛）犃．６．１ 成分氯化钠８ｇ磷酸二氢钾０．２ｇ磷酸氢二钾２．９ｇ氧化钾０．２ｇ水１０００ｍＬ犃．６．２ 制法将各成分溶解于蒸馏水中，用１ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠调至ｐＨ７．２。１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ，用蒸馏水加至１０００ｍＬ贮存冰箱。６犛犖／犜０１８４．３—２００８附 录 犅（规范性附录）单核细胞增生李斯特氏菌检验程序图犅．１ 单核细胞增生李斯特氏菌检验程序图犛犖／犜０１８４．３—２００８