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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２９４８—２０１１国境口岸蜱传新疆出血热病毒快速检测方法犚犪狆犻犱犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳狋犻犮犽犫狅狉狀犲犡犻狀犼犻犪狀犵犺犲犿狅狉狉犺犪犵犻犮犳犲狏犲狉狏犻狉狌狊犪狋犳狉狅狀狋犻犲狉狆狅狉狋２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：师永霞、李小波、相大鹏、孙肖红、洪烨、郑夔、黄吉城、幸芦琴、郭波旋、钟玉清。Ⅰ犛犖／犜２９４８—２０１１国境口岸蜱传新疆出血热病毒快速检测方法１ 范围本标准规定了国境口岸蜱传新疆出血热检测的生物安全要求，标本的采集、运输和保存，标本的处理，蜱传新疆出血热的免疫胶体金检测，ＲＴＰＣＲ检测和实时荧光ＲＴＰＣＲ检测方法。本标准适用于国境口岸入出境人员或媒介蜱携带新疆出血热病毒的快速检测。２ 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ１９４８９ 实验室 生物安全通用要求３ 缩略语下列缩略语适用于本文件。ＲＴＰＣＲ：反转录聚合酶链反应实时荧光ＲＴＰＣＲ：实时荧光反转录聚合酶链反应Ｃｔ值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数ＲＮＡ：核糖核酸ＦＡＭ：ＦＡＭ荧光染料，一种荧光报告基团４ 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。４．１新疆出血热（克罗米亚刚果出血热） 犡犻狀犼犻犪狀犵犺犲犿狅狉狉犺犪犵犻犮犳犲狏犲狉（犆狉犻犿犲犪狀犆狅狀犵狅犺犲犿狅狉狉犺犪犵犻犮犳犲狏犲狉）是由新疆出血热病毒（克罗米亚刚果出血热病毒）引起的、硬蜱传播的自然疫源性传染病。临床上以发热、头痛、出血、低血压休克为特征。亚洲璃眼蜱（犎狔犪狋狅犿犿犪犪狊犻犪狋犻犮狌犿）是本病的主要传播媒介。５ 生物安全要求新疆出血热病毒相关材料的生物安全要求如下：———新疆出血热病毒相关的感染性材料的操作应在生物安全Ⅲ级（ＢＳＬ３或ＡＢＳＬ３）实验室内进行；———新疆出血热病毒相关的灭活材料在生物安全Ⅱ级（ＢＳＬ２）实验室内进行；———新疆出血热病毒感染性材料运输包装分类为Ａ类，ＵＮ编号为ＵＮ２８１４。１犛犖／犜２９４８—２０１１６ 标本的采集、运输和保存６．１ 人血清无菌采集疑似患者发病５ｄ内静脉血３ｍＬ～５ｍＬ，室温静置３０ｍｉｎ使其凝固，５００犵离心１０ｍｉｎ，收集血清于２ｍＬ无菌螺口塑料管中，用耐低温油性记号笔记上编号，低温送到实验室检测或－７０℃以下保存待检。６．２ 硬蜱根据实际工作需要采集蜱标本。将采集的蜱直接放入－２０℃冰箱冻死后，取出，分类编号，按３０只～５０只一份，装入２ｍＬ螺口塑料血清管内，用耐低温油性记号笔记上编号，低温运输或－７０℃以下保存待检。７ 标本的处理７．１ 血清标本血清标本直接进行胶体金检测和分子生物学核酸的提取，如不能及时检测应存放在－７０℃冰箱。７．２ 蜱标本７．２．１ 在冰上操作。从－７０℃容器中取出蜱标本，倒入研磨器中。７．２．２ 加入１ｍＬＰＢＳ或生理盐水吹洗，弃去液体后加入１ｍＬＰＢＳ或生理盐水，反复研磨至组织碎片基本消失。７．２．３ 将研磨液吸入１．５ｍＬ离心管，配平后置预冷４℃的离心机上，２００００犵离心１０ｍｉｎ。７．２．４ 取上清液进行胶体金检测和分子生物学核酸的提取。８ 蜱传新疆出血热的免疫胶体金检测８．１ 仪器本方法使用的主要仪器如下；———生物安全柜；———移液器：１００μＬ、２００μＬ。８．２ 试剂新疆出血热免疫胶体金检测试剂盒：由广州万孚生物技术有限公司提供１）。８．３ 检测步骤８．３．１ 将免疫胶体金试剂盒内的检测卡、样本处理液等置于室温下平衡。８．３．２ 取适量体积的血清样本或蜱样本的处理液，与等体积的样本处理液混匀。８．３．３ 吸取８０μＬ的混合液于检测卡的样品孔中。１） 由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。２犛犖／犜２９４８—２０１１８．３．４ １０ｍｉｎ后观察结果，最长不超过１５ｍｉｎ。８．４ 结果判断根据以下条件进行结果判定：———阳性结果：在检测区（Ｔ）及对照区（Ｃ）各出现一条色带；———阴性结果，仅在对照区出现一条色带；———检测无效；在对照区无红色条带出现，应重新进行检测。９ 犚犜犘犆犚检测９．１ 主要仪器９．１．１ ＰＣＲ扩增仪。９．１．２ 天平。９．１．３ 超净工作台。９．１．４ 生物安全柜。９．１．５ 高压灭菌锅。９．１．６ 低温高速离心机：最大离心力２００００犵。９．１．７ 电泳仪。９．１．８ 凝胶成像分析系统。９．１．９ 旋涡振荡器。９．１．１０ 冰箱：４℃、－２０℃和－７０℃。９．１．１１ 移液器：１０μＬ、２０μＬ、１００μＬ、２００μＬ和１ｍＬ。９．１．１２ 恒温水浴锅。９．２ 主要试剂除另有规定外，所有试剂均采用分析纯。９．２．１ 核酸提取试剂：用美国Ｑｉａｇｅｎ公司ＱＩＡａｍｐＶｉｒａｌＲＮＡＫｉｔ提取病毒核酸２）。９．２．２ ＲＴＰＣＲ试剂：美国Ｑｉａｇｅｎ公司ＯｎｅｓｔｅｐＲＴＰＣＲｋｉｔ２）。９．２．３ 无ＲＮＡ酶的ＤＥＰＣ水。９．２．４ ＲＴＰＣＲ检测的引物：上游引物ＸＪＦＰ（５’ＡＴＤＣＲＧＧＨＡＣＣＡＴＹＡＡＲＴＣＴＴＧＧＧＡ３’）和下游引物ＸＪＲＰ（５’ＣＫＲＡＴＣＡＴＲＴＣＷＧＡＨＡＲＣＡＴＹＴＣ３’），预期扩增片段为２３１ｂｐ。９．２．５ 电泳缓冲液（ＴＡＥ）：称取２４２ｇＴｒｉｓ碱，溶于７００ｍＬ的ｄｄＨ２Ｏ中，加入１００ｍＬ０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），５７．１ｍＬ冰乙酸，至充分溶解后用水定容至１Ｌ，室温储存。９．２．６ 溴化乙锭（ＥＢ）：１０ｍｇ／ｍＬ，使用浓度为０．５μｇ／ｍＬ。９．３ 检测步骤９．３．１ 核酸提取９．３．１．１ 吸取１４０μＬ血清样本或蜱样本处理液加入溶解的裂解液ＡＶＬ。９．３．１．２ 脉冲混匀１５ｓ，置于室温１０ｍｉｎ。２） 由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。３犛犖／犜２９４８—２０１１９．３．１．３ 短暂离心，加入５６０μＬ乙醇（９６％～１００％）脉冲混匀１５ｓ。９．３．１．４ 短暂离心。９．３．１．５ 将ＱＩＡａｍｐ旋转柱置于２ｍＬ收集管中。从步骤３中吸取６３０μＬ溶液转移至旋转柱上，６０００犵离心１ｍｉｎ，将旋转柱放至干净的收集管上，丢弃包含过滤液的收集管。９．３．１．６ 打开旋转柱盖，重复步骤５。９．３．１．７ 打开旋转柱盖，加入５００μＬ洗液ＡＷｌ，盖紧盖子，６０００犵离心１ｍｉｎ。将旋转柱放至干净的收集管上，丢弃包含过滤液的收集管。９．３．１．８ 打开旋转柱盖，加入５００μＬ洗液ＡＷ２，盖紧盖子，２００００犵离心３ｍｉｎ。将旋转柱放至干净的收集管上，２００００犵再离心１ｍｉｎ。将旋转柱放至干净的１．５ｍＬ离心管上，丢弃包含过滤液的收集管。９．３．１．９ 打开旋转柱盖，加入６０μＬ室温平衡的缓冲液ＡＶＥ。９．３．１．１０ 盖紧盖子，室温放置１ｍｉｎ。９．３．１．１１ ６０００犵离心１ｍｉｎ。９．３．１．１２ 收集滤出液，用于ＲＴＰＣＲ扩增。－２０℃或－７０℃储存ＲＮＡ。９．３．２ 犚犜犘犆犚检测９．３．２．１ 准备ＲＴＰＣＲ反应液，设５０μＬ反应体系，每个待检标本反应液的组成为：５×ＲＴＰＣＲ缓冲液１０μＬ，１０ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ２μＬ，１０ｍｍｏｌ／ＬＸＪＦＰ５μＬ，１０ｍｍｏｌ／ＬＸＪＲＰ５μＬ，ＲＴＰＣＲＥｎｚｙｍｅｍｉｘ２μＬ，无ＲＮＡ酶的ＤＥＰＣ水２１μＬ，ＲＮＡ模板５μＬ。同时设立阴性对照和阳性对照，阳性对照模板可为新疆出血热病毒核酸，也可为根据病毒核苷酸序列体外转录的ＲＮＡ片段；阴性对照模板为不含新疆出血热病毒核酸的标本或无ＲＮＡ酶的水。９．３．２．２ 将ＰＣＲ反应管置于ＰＣＲ扩增仪上进行操作，ＲＴＰＣＲ反应程序为：５０℃逆转录３０ｍｉｎ，９５℃预变性１５ｍｉｎ；９４℃变性１ｍｉｎ，５０℃复性１ｍｉｎ，７２℃延伸１ｍｉｎ，３５个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ，４℃。９．３．３ 凝胶电泳扩增结束后，在５μＬ扩增产物中加入１μＬ６×ＤＮＡ上样缓冲液，用含０．５μｇ／ｍＬ溴化乙锭的１．５％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，用凝胶成像系统照相记录结果。９．４ 结果判断９．４．１ 质量控制反应结果应同时符合以下两个条件：———阴性对照未出现特异性条带；———阳性对照出现预期２３１ｂｐ大小的扩增条带。９．４．２ 结果分析在实验结果有效情况下，如待测样品出现预期２３１ｂｐ大小的扩增条带，则可初步判断待测样品新疆出血热病毒核酸ＰＣＲ阳性，初步判断为阳性结果的样品可通过复检和核酸序列测定进行确认。如待测样品中未出现预期大小的扩增产物，则可判断待测样品新疆出血热病毒核酸ＰＣＲ阴性。９．５ 测序（可选择）将ＰＣＲ扩增产物进行序列测定，确定其碱基组成。使用ＢＬＡＳＴ分析其与已公布的新疆出血热Ｓ基因序列的同源性，判断扩增产物是否为新疆出血热病毒核酸。４犛犖／犜２９４８—２０１１１０ 实时荧光犚犜犘犆犚检测１０．１ 主要仪器１０．１．１ 荧光定量ＰＣＲ仪。１０．１．２ 超净工作台。１０．１．３ 生物安全柜。１０．１．４ 高压灭菌锅。１０．１．５ 低温高速离心机：最大离心力２００００犵。１０．１．６ 旋涡振荡器。１０．１．７ 冰箱：４℃、－２０℃和－７０℃。１０．１．８ 移液器：１０μＬ、２０μＬ、１００μＬ、２００μＬ和１ｍＬ。１０．２ 主要试剂１０．２．１ 核酸提取试剂：用美国Ｑｉａｇｅｎ公司ＱＩＡａｍｐＶｉｒａｌＲＮＡＫｉｔ提取病毒核酸３）。１０．２．２ 实时荧光ＲＴＰＣＲ通用试剂：ＡｇＰａｔｈＩＤＴＭＯｎｅｓｔｅｐＲＴＰＣＲＫｉｔ，美国Ａｍｂｉｏｎ公司产品３）。１０．２．３ 无ＲＮＡ酶的ＤＥＰＣ水。１０．２．４ 引物和探针：引物和探针序列见表１。表１ 新疆出血热病毒实时荧光犚犜犘犆犚检测的引物和探针引物／探针名称序列（５’３’）扩增片段ＣＣＲｅａｌＦＰ１ＴＹＴＴＴＧＣＨＧＡＴＧＡＹＴＣＨＴＴＹＣＣＣＲｅａｌＲＰ１ＡＣＲＧＧＧＡＴＫＧＴＹＣＣＲＡＡＧＣＡＣＣＲｅａｌＰｒ１ＦＡＭＡＣＡＧＲＡＴＣＴＡＹＡＴＧＣＡＹＣＣＴＧＣＢＨＱｌＣＣＲｅａｌＦＰ２ＲＧＡＧＴＧＧＴＧＣＡＧＧＧＡＡＴＴＴＧＣＣＲｅａｌＲＰ２ＣＡＤＧＧＹＧＧＲＴＴＧＡＡＡＧＣＣＣＲｅａｌＰｒ２ＦＡＭＣＡＡＡＧＧＣＡＡＧＴＡＣＡＴＣＡＴＭＧＢ预期扩增片段为１０６ｂｐ预期扩增片段为５７ｂｐ１０．３ 核酸提取见９．３．１。１０．４ 加样准备实时荧光ＲＴＰＣＲ反应液，设２０μＬ反应体系，每个待检标本反应液的组成为：２×ＲＴＰＣＲ缓冲液１０μＬ、１０μｍｏｌ／ＬＣＣＲｅａｌＦＰ１（或ＣＣＲｅａｌＦＰ２）１μＬ、１０μｍｏｌ／ＬＣＣＲｅａｌＲＰ１（或ＣＣＲｅａｌＲＰ２）１μＬ、５μｍｏｌ／ＬＣＣＲｅａｌＰｒ１（或ＣＣＲｅａｌＰｒ２）１μＬ、２５×ＲＴＰＣＲＥｎｚｙｍｅＭｉｘ０．８μＬ、模板ＲＮＡ６．２μＬ。同时设立阴性对照和阳性对照，阳性对照模板可为新疆出血热病毒核酸，也可为根据病毒核苷酸序列体外合成的ＲＮＡ片段，阴性对照模板为不含新疆出血热病毒核酸的标本或无ＲＮＡ酶的水。３） 由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。５犛犖／犜２９４８—２０１１１０．５ 实时荧光犚犜犘犆犚扩增反应在不同的荧光定量ＰＣＲ仪上，犜犪狇Ｍａｎ探针实时荧光ＲＴＰＣＲ的反应条件略有不同。以ＲｏｃｈｅＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ或ＡＢＩ７９００ＨＴ荧光定量ＰＣＲ仪