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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２８６５—２０１１尼帕病毒病检疫技术规范犘狉狅狋狅犮狅犾狅犳狇狌犪狉犪狀狋犻狀犲犳狅狉犖犻狆犪犺狏犻狉狌狊犱犻狊犲犪狊犲２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准参考了世界动物卫生组织（ＯＩＥ）《陆生动物诊断试验与疫苗标准手册》（２００４版）２．１０．１０条“亨得拉和尼帕病毒病”。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：朱来华、梁成珠、郑小龙、岳志芹、肖西志、邓明俊、谭乐义、辛学谦。Ⅰ犛犖／犜２８６５—２０１１尼帕病毒病检疫技术规范１ 范围本标准规定了尼帕病毒病的病毒分离鉴定、电镜观察、免疫组织化学试验、微量血清中和试验、酶联免疫吸附试验等检疫方法。本标准适用于进出境动物尼帕病毒病的检疫。２ 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法３ 概述３．１ 尼帕病毒（Ｎｉｐａｈｖｉｒｕｓ，ＮｉＶ）病是一种新出现的人畜共患传染病。尼帕病毒病的病原是副黏病毒科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）成员，能够感染人、猪等多种动物。在猪群内传播迅速，症状却不明显，在人群中有人传人的可能，并且人感染ＮｉＶ之后，死亡率高达４０％～７０％。３．２ ＮｉＶ可以感染各个年龄段的猪，不同类别的猪表现出不同的临床症状，例如母猪首先表现为神经症状，而肉用猪表现为呼吸道症状，此外，圈养的母猪和公猪活动受到限制，可能掩盖其呼吸道症状。３．３ 人、猫、狗和马也可以感染ＮｉＶ。人感染ＮｉＶ后，多数以神经症状为主，也可以呼吸道症状为主，死亡率很高；狗感染ＮｉＶ后，可出现类似犬瘟热症状；猫感染ＮｉＶ后，死亡率很高；马感染ＮｉＶ后可以出现神经症状，但是死亡率似乎较低。所以在临床诊断时，应注意感染的猪场及其周围人和其他动物的发病情况，注意发病猪场新近是否引进新猪。因尼帕病毒病是可感染人和多种动物的人畜共患传染病，所以处理带有或可能带有此活病毒的样品必须在ＢＳＬ４生物安全实验室内操作。３．４ 死后剖检发现ＮｉＶ感染猪没有特征性病变，肺和脑膜是主要的病变器官。大多数病例表现由轻微到严重的肺部病变，包括程度不同的实变、气肿、淤血性溢血以及呼吸道有带血丝的分泌物，切开肺部，可见肺小叶间隔肿胀。脑膜弥漫性充血、水肿，其他的内脏器官没有明显的变化。４ 病毒分离鉴定４．１ 试剂、材料与仪器４．１．１ 试剂与材料：Ｖｅｒｏ细胞或ＲＫ１３细胞、ＥＭＥＭ或其他培养基、抗生素贮存液、细胞消化液、细胞培养液和细胞维持液、细胞瓶和各种常规试剂等（见附录Ａ）。试验用水应符合ＧＢ／Ｔ６６８２要求。４．１．２ 仪器：生物安全柜或超净工作台、倒置显微镜、高速冷冻离心机、二氧化碳培养箱、高压灭菌锅等。４．２ 样品采集与处理４．２．１ 样品采集与运送：无菌采集动物脑、肺、肾和脾脏等组织，４℃保存运送到ＢＳＬ４级生物安全实１犛犖／犜２８６５—２０１１验。也可用干冰保存运送，但病料不能长期存放在－２０℃。４．２．２ 样品处理：无菌处理样品，样品称量，置于无菌密闭容器内，加入少量组织培养液和抗菌素，用无菌研槌研磨，制备成组织悬液。再加组织培养液，使最终为１０％组织悬液。以１５００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，小心收取上清液低温保存备用。４．３ 病毒分离４．３．１ 将上述上清液用维持液作倍比稀释，无菌接种于已长成单层的Ｖｅｒｏ或ＲＫ１３细胞瓶或细胞培养板上，每个滴度接种两瓶或两孔。同时设立细胞对照和阳性对照，单层细胞仅加维持液做细胞对照，用６０倍稀释的标准病毒接种做阳性对照。４．３．２ 加盖摇匀使之均匀分布于整个细胞层，置于３７℃孵育１ｈ。加入维持液置于３７℃继续培养，逐日观察细胞病变（ＣＰＥ），尼帕病毒（ＮｉＶ）一般在３ｄ内出现ＣＰＥ。４．３．３ 无ＣＰＥ出现者应盲传两代，即将细胞培养物冻融两次，再接种到单层细胞培养５ｄ～７ｄ。出现ＣＰＥ者，待７０％细胞出现ＣＰＥ时，收取细胞毒。将感染细胞反复冻融数次，２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，小心收集上清液，分装后低温保存，待进一步进行病毒鉴定。４．３．４ 用微量血清中和试验或其他方法对分离的病毒进行鉴定。４．４ 结果判定检查各种对照试验，细胞对照正常，无ＣＰＥ；阳性对照出现明显的ＣＰＥ，说明试验成立。如果试验组出现明显的ＣＰＥ，表现为细胞圆缩、脱落、裂解，则初步判定为病毒分离阳性；如果分离的细胞培养物能被ＮｉＶ阳性血清中和或被其他方法鉴定，则分离的病毒为ＮｉＶ。５ 电镜观察５．１ 试剂、材料与仪器５．１．１ 试剂与材料：２．５％戊二醛溶液、０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液、乙酸异戊酯、乙醇、双蒸水、显影液、定影液、ＮｉＶ、Ｖｅｒｏ细胞等。５．１．２ 仪器：扫描电镜、临界点干燥仪、离子溅射镀膜仪、底片扫描仪。５．２ 操作方法５．２．１ 用小盖玻片培养接毒的贴壁细胞。５．２．２ 用０．１ｍｏｌ／Ｌ，磷酸缓冲液（ｐＨ７．２）洗两次。５．２．３ 固定：用２，５％戊二醛溶液室温于通风橱固定１ｈ。固定完后用０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液和蒸馏水充分洗净。５．２．４ 脱水：洗净后用３５％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％乙醇逐渐上升脱水。每级各５ｍｉｎ。５．２．５ 置换：用乙醇∶乙酸异戊酯（１∶１）混合液及１００％乙酸异戊酯依次置换５ｍｉｎ，最后将样品浸于乙酸异戊酯１５ｍｉｎ。５．２．６ 临界点干燥：在干燥前先通过放入液体二氧化碳使得仪器压力罐温度降到低于室温１０℃，接着将样品放入小篮中置于罐内。打开进口阀，放入液体二氧化碳，至充满罐的５０％～８０％体积。再升温至２０℃，使得二氧化碳置换乙酸异戊酯２０ｍｉｎ，再升温至４０℃，此时压力应该大于８０ｋｇ／ｃｍ２。保持５ｍｉｎ后，缓慢将二氧化碳气体放出，时间大概２ｈ左右。待压力降到０时，再调节温度至室温，取出样品，暂存干燥器中备用。５．２．７ 喷镀：将已干燥好的样品用导电胶粘于金属的样台上，再一起置于真空喷镀仪真空罩中，进行喷镀金铂合金镀层，完成后电镜下观察。２犛犖／犜２８６５—２０１１５．２．８ 电镜观察。５．３ 结果判定如果电镜观察显示：病灶原生质膜增厚呈头发样，多核细胞突出，核正常。细胞外病毒粒子呈多形性（球形或细长形），大小为５０ｎｍ～５００ｎｍ不等，病毒粒子被有许多表面突起的膜包裹，核衣壳呈各异的螺旋状和人字形，并被囊膜所包被，则可初步判定为ＮｉＶ阳性。６ 免疫组织化学试验６．１ 原理免疫组化法用于检测福尔马林固定的组织或细胞，该方法还可以检测存放已久的病料，用于调查以往该病发生的情况。在发病动物的很多组织中都可以检测到该病毒，病料采集范围包括：不同的脑组织、脾脏、肾脏和纵隔淋巴结等。孕畜还应包括子宫、胎盘和胎儿的器官等。６．２ 试剂、材料与仪器６．２．１ 试剂与材料：固定液、石蜡、玻片、二甲苯、无水乙醇、胰蛋白酶、脱脂奶粉、兔抗尼帕病毒抗体、酶标二抗、显色液、Ｓｃｏｔｔ’ｓ溶液、Ｈ２Ｏ２、中性封片剂和各种常规试剂等（见附录Ｂ）。６．２．２ 仪器：切片机和显微镜等。６．３ 病料处理６．３．１ 将采集的病料浸入１０倍体积的固定液中固定。７ｄ后更换固定液，再维持一周。６．３．２ 将选取好的组织块放入新配的固定液中再固定７ｄ，其间更换固定液三次，并在水平摇床上不断摇荡，以提高固定液的渗透力。６．３．３ 将固定好的组织块放入流水中漂洗２４ｈ。６．３．４ 放入下列不同浓度的酒精中脱水：７５％酒精２ｈ→８５％酒精２ｈ→９５％酒精Ⅰ２ｈ→９５％酒精Ⅱ２ｈ→１００％酒精Ⅰ２ｈ→１００％酒精Ⅱ２ｈ。６．３．５ 放入香柏油和二甲苯中透明：香柏油中１２ｈ→二甲苯Ⅰ１ｈ→二甲苯Ⅱ１ｈ。６．３．６ 浸蜡：软蜡中放置４０ｍｉｎ；硬蜡中放置２ｈ。６．３．７ 将浸好蜡的组织块放入包埋框中用硬蜡包埋，４℃冷却过夜。６．３．８ 将石蜡块切成５μｍ厚的切片，用干净的载玻片贴片。６．４ 操作方法６．４．１ 脱蜡：依次将切片放入二甲苯二甲苯二甲苯各１ｍｉｎ，无水乙醇无水乙醇７０％乙醇各５ｍｉｎ，然后用流水冲洗。６．４．２ 将切片置于蒸馏水中漂洗，然后浸入包含０．１％（质量浓度）胰蛋白酶的０．０１ｍｏｌ／Ｌ氯化钙中（用０．１ｍｏｌ／Ｌ的氢氧化钠调ｐＨ值至７．８），３７℃放置２０ｍｉｎ，用蒸馏水冲洗。６．４．３ 将切片放入湿盒内用ＰＢＳ漂洗５ｍｉｎ。洗完后用吸水纸吸干组织块周围的液体，每张切片上滴加２００μＬ３％的Ｈ２Ｏ２溶液，室温放置２０ｍｉｎ，然后倒掉Ｈ２Ｏ２，放入ＰＢＳ中漂洗５ｍｉｎ。６．４．４ 洗完后用吸水纸吸干组织块周围的液体，向切片上滴加２００μＬ适当稀释的兔抗尼帕病毒抗体（用包含０．１％脱脂奶粉的ＰＢＳ稀释，每份样品和对照均要设立平行试验），将切片封好置于３７℃孵育１ｈ。 ６．４．５ 将切片放入ＰＢＳ中漂洗５ｍｉｎ，洗完后用吸水纸吸干组织块周围的液体，滴加２滴～３滴酶标二３犛犖／犜２８６５—２０１１抗，３７℃孵育２０ｍｉｎ。６．４．６ 将切片放入ＰＢＳ中漂洗５ｍｉｎ，洗完后用吸水纸吸干组织块周围的液体，滴加显色液，在显微镜下观察染色程度。阳性对照切片染色充分后（通常２ｍｉｎ～５ｍｉｎ），用蒸馏水漂洗终止反应。６．４．７ 将切片用ＰＢＳ漂洗５ｍｉｎ，洗完后用吸水纸吸干组织块周围的液体，放入苏木素中复染１ｍｉｎ～３ｍｉｎ，用蒸馏水冲洗，加入Ｓｃｏｔｔ’ｓ溶液，流水冲洗。蒸馏水漂洗切片，用中性封片剂封片。６．４．８ 显微镜观察６．５ 结果判定如果镜检切片显示细胞质可见褐色／红色颗粒状着色点，细胞核呈蓝色，则判定为ＮｉＶ阳性。７ 微量血清中和试验７．１ 试剂、材料与仪器７．１．１ 试剂与材料：细胞培养液、细胞维持液、细胞消化液和抗生素贮存液等，标准阳性血清、阴性血清和被检血清经５６℃灭能３０ｍｉｎ备用，Ｖｅｒｏ细胞和尼帕病毒株ＮｉＶ（见附录Ａ）。７．１．２ 仪器：生物安全柜、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、液氮贮存罐、微量细胞培养板等。７．２ 操作方法７．２．１ 中和病毒滴度（犜犆犐犇５０）测定７．２．１．１ 中和病毒制备将保存于液氮中的ＮｉＶ种毒取出置于４℃缓慢融化，将融化的种毒用维持液作６０倍稀释后，取１ｍＬ接种于长成单层Ｖｅｒｏ细胞的细胞瓶中，吸附１ｈ。先用维持液洗涤一次，再加入维持液，放置于３７℃恒温箱中培养３６ｈ～４８ｈ，当５０％～７５％细胞出现ＣＰＥ，即可收获病毒培养液，分装成１ｍＬ后冻存（－７０℃以下）备用。７．２．１．２ 病毒滴度测定在微量细胞培养板（９６孔）每孔加２５μＬ细胞培养液，用病毒稀释液将冻存病毒作１０－１，１０－２……１０－８系列稀释，每一稀释度的病毒接种八孔，每孔２５μＬ。正常细胞对照，四孔至八孔不加病毒，仅加２５μＬ病毒稀释液。每孔１００μＬＶｅｒｏ细胞（２．４×１０４／１００μＬ），置３７℃培养，４８ｈ后初判，７２ｈ终判。如细胞对照正常，接种病毒的细胞出现ＣＰＥ（细胞圆缩、脱离、裂解），记录试验数据。根据Ｋａｒｂｅｒ法计算该批病毒的毒价（半数组织感染量ＴＣＩＤ５０）。７．２．２ 微量血清中和试验７．２．２．１ 在９６孔细胞培养板上每孔加２５μＬ细胞培养液。第一列四孔作被检血清（毒性）对照，每孔加２５μＬ被检血清，用移液器混匀后弃２５μＬ；第二列四孔，每孔加２５μＬ被检血清，混匀后吸出２５μＬ至第三孔，依次倍比稀释到第四孔，即血清稀释为１∶２、１∶４和１∶８，每一稀释度各四孔。７．２．２．２ 用病毒稀释液将病毒稀释成工作浓度２００ＴＣＩＤ５０，第一列四孔加病毒稀释液（无病毒）作被检血清（毒性）对照，第二至四列的各孔加２５μＬ稀释的病毒。盖上培养板，轻轻摇匀，放入二氧化碳保湿培养箱（５％二氧化碳）３７℃孵育１ｈ。阴、阳性血清对照（方法同上）。７．２．２．３ 病毒滴度验证试验，将工作浓度的中和病毒再作１