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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２８４６—２０１１鹦鹉热检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犮犺犾犪犿狔犱犻犪狆狊犻狋狋犪犮犻２０１１０２２５发布２０１１０７０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准鹦鹉热检疫技术规范ＳＮ／Ｔ２８４６—２０１１中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６ ６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６ 印张１．２５ 字数３３千字２０１１年６月第一版 ２０１１年６月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２２１２７ 定价２１．００元书书书前 言 本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准参考了国际动物卫生组织《陆生动物诊断试验与疫苗手册》（２００８版）第２．３．１章中禽衣原体病诊断中的相关技术。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国山西出入境检验检疫局、中华人民共和国重庆出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人：邓明俊、肖西志、岳志芹、凌宗帅、辛学谦、孙敏、廉慧锋、吴丰春、张伟、谷强。Ⅰ犛犖／犜２８４６—２０１１鹦鹉热检疫技术规范１ 范围本标准规定了鹦鹉热的临床诊断、鹦鹉热衣原体的分离培养技术、组织化学染色技术、聚合酶链式反应（ＰＣＲ）、限制性片段长度多态分析（ＰＣＲＲＦＬＰ）、补体结合试验（ＣＦＴ）操作的技术要求。本标准适用于进出口禽鸟（如：鸽子、鹦鹉、火鸡等）鹦鹉热的检疫、鹦鹉热病原的实验室诊断和血清学调查；也适用于兽医相关部门对鹦鹉热疾病的流行病学调查以及对衣原体分类学研究。２ 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法３ 临床诊断３．１ 发病症状鹦鹉热情况参见附录Ａ。临床诊断时要注意观察鸟（禽）的精神状态、呼吸状况、眼部的异常变化以及粪便的状态和颜色。根据衣原体血清型和禽类宿主的不同，衣原体可引起心周炎、气囊炎、肺炎、鼻炎、腹膜炎、肝炎和脾炎，全身性感染导致发热、厌食、呆滞、腹泻，有时出现惊厥和死亡。在临床诊断观察中应根据不同种类的鸟禽重点注意以下几点：———成年鹦鹉通常表现轻微症状，幼龄鹦鹉则可发生急性或致死性传染。病鹦鹉不食、精神萎顿、羽毛松乱，沾有黄绿色稀粪，有黏液性鼻液，眼睛被分泌物糊住，死前常呈现严重脱水或消瘦症状；———急性型的病鸭发病严重，表现出震颤、步态不稳、食欲消失、腹泻，排出淡绿色粪便。眼睛和鼻孔流出浆液性或脓性分泌物，眼睛周围羽毛上有分泌物结成的痂块。随后病鸭明显消瘦和肌肉萎缩。末期常发生惊厥而死亡；———成年鸽表现不安，厌食，眼鼻流液，腹泻，粪便为淡灰色或淡绿色，一侧或两侧结膜炎，呼吸发生水泡音，有时颈和两肢发生瘫痪，雏鸽发病后呈现衰弱和消瘦，常有腹泻症状；———火鸡常表现出厌食、精神萎顿、腹泻，粪便为液体状，常带血，严重消瘦。３．２ 病理变化鹦鹉热衣原体攻击靶器官具有多样性，其组织学病变主要集中在肺脏、气囊、肝脏、气管和肾脏。组织病理学特征主要表现为肺充血、水肿、在二、三级支气管中有蛋白分泌物和透明膜形成。肝细胞变形，肝窦隙有淋巴细胞与单核细胞浸润。肾小管上皮细胞变形。气管黏膜腺分泌旺盛，假复层柱状纤毛上皮细胞脱落，纤毛消失。剖检发病禽（鸟）只，其心肌纤维和法氏囊一般未见异常。鹦鹉热的病理变化在各类禽鸟之间差别较大，但其共同特征都可见气囊炎，并出现从轻度云雾状浑浊至出现干酪样渗出物，严重病例出现肠炎、肝肿大且有坏死灶、纤维蛋白性心包炎。鸭、鸡、鸽与鹦鹉在病理变化上又有不同之处。观察其病理变化应注意以下几点：１犛犖／犜２８４６—２０１１———在临床上呈现流泪和流鼻液的病鸭，剖检时可出现结膜炎、鼻炎、眶下窦炎。病鸭的胸肌萎缩和全身性多发性浆膜炎，常有浆液性或浆液纤维蛋白性心包炎，肝脾肿大且表面有灰色或黄色小坏死灶；———鸽子发病时，可见肝肿大并严重充血，肝脏实质表面常散布有针尖大小的坏死灶。脾脏异常肿大，被膜破裂，内有出血；———鸡发病时，鸡只均表现出肺充血，水肿、单侧或双侧肺有纤维性渗出物，肺边缘粘连。单侧或双侧肺气囊浑浊，增厚，气囊表面有点状、散在分布的黄白色纤维性渗出物。肝脏肿大，质脆，色变淡，偶见坏死灶。４ 实验室诊断４．１ 样品的采集对死亡禽（鸟），无菌采集病变器官内外的炎性或纤维性渗出物、眼和鼻渗出物、全血及肾、肺、脾、心包和肝组织等样品。有腹泻症状的禽（鸟），采集结肠内容物或分泌物进行培养。活禽（鸟），采集咽和鼻拭子、肠分泌物、泄殖腔拭子、结膜刮取物和腹腔渗出物。为防止衣原体感染性降低或丧失，采集的样品置于冷的灭菌的蔗糖磷酸盐谷氨酸盐溶液（ＳＰＧ溶液，配制详见附录Ｂ）快速送至实验室。采集的样品在接种动物或细胞前应经过必要的前处理。４．２ 样品的前处理４．２．１ 抗生素处理对采集的组织样品，用含链霉素（１ｍｇ／ｍＬ）、万古霉素（１ｍｇ／ｍＬ）、卡那霉素（１ｍｇ／ｍＬ）、庆大霉素（２００μｇ／ｍＬ）的磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ，ｐＨ７．２）将采集的病料样品制成匀浆，５℃环境下放置２４ｈ后，取上清液备用（接种鸡胚、豚鼠、小鼠或细胞）。为阻止酵母和真菌的生长，可加两性霉素Ｂ（５０μｇ／ｍＬ）。禁用可抑制衣原体生长的青霉素、四环素和氯霉素等抗生素。４．２．２ 抗生素结合低速离心处理对有一定污染的样品（如：粪便、拭子等），用抗生素溶液将其匀浆后，５００犵离心２０ｍｉｎ，除去表层和底层，收集上清液，离心后取上清液备用。４．２．３ 过滤处理对污染较为严重的样品，经过上述处理后，用孔径为４５０μｍ的滤膜过滤，收集滤液备用。４．３ 病原分离４．３．１ 操作要求由于鹦鹉热衣原体在自然条件下或实验室内都可能感染人，因此鹦鹉热衣原体的细胞培养和鸡胚分离等病原分离操作过程应在有一定生物安全设施的实验室内完成。４．３．２ 试剂与材料４．３．２．１ ＶＥＲＯ细胞（或ＢＧＭ、ＭｃＣＯｙ、ＨｅＬａ、Ｌ细胞）。４．３．２．２ ＭＥＭ培养基。４．３．２．３ ６日龄～７日龄ＳＰＦ鸡胚。２犛犖／犜２８４６—２０１１４．３．２．４ 胎牛血清（无ＧＰＳ抗体）。４．３．２．５ 抗生素（万古霉素、链霉素、卡那霉素、庆大霉素及制霉菌素）。４．３．２．６ 放线菌酮。４．３．２．７ 各种细胞培养用常规试剂。４．３．２．８ 细胞瓶及细胞培养板。４．３．３ 主要设备４．３．３．１ 超净工作台或生物安全柜。４．３．３．２ 台式离心机。４．３．３．３ 倒置显微镜。４．３．３．４ 二氧化碳细胞培养箱。４．３．３．５ 高压灭菌锅。４．３．４ 细胞培养分离鹦鹉热衣原体４．３．４．１ 细胞准备用含５％～１０％胎牛血清和抗生素的ＭＥＭ培养液，将细胞培养成单层。抗生素的种类和浓度的选择可参照４．２．１。４．３．４．２ 细胞接种吸去细胞单层表面的培养液，每孔接种０．１ｍＬ预先处理好的病料样品，置３７℃静止吸附１ｈ～２ｈ。在细胞培养分离衣原体过程中，为提高衣原体的感染性，将单层细胞上的接种物稍作离心（３７℃条件下经５００犵～１５００犵离心３０ｍｉｎ～９０ｍｉｎ），促使衣原体与细胞充分吸附。４．３．４．３ 细胞增殖衣原体吸去细胞表面的接种物，每孔加入０．２ｍＬ含有放线菌酮（０．５μｇ／ｍＬ～２．０μｇ／ｍＬ）的细胞培养液，置５％二氧化碳培养箱，在３７℃～３９℃温度下连续培养５ｄ～６ｄ。如果选用依米丁做细胞分裂抑制剂，单层细胞先用０．５μｇ／ｍＬ依米丁溶液３７℃孵育５ｍｉｎ，用ＰＢＳ洗液洗去依米丁溶液后更换为细胞培养液，置３９℃含５％二氧化碳培养箱内培养。细胞培养２ｄ～３ｄ或４ｄ～５ｄ后，对培养物进行染色鉴定。第５天后染色检查仍为阴性的，收集培养物再盲传一次。衣原体的染色检查过程中，应尽量避免细胞冻融破碎。细胞培养物染色之前，先吸弃培养液，用ＰＢＳ洗涤后，用丙酮和甲醇１∶１的混合液固定５ｍｉｎ。对细胞增殖的鹦鹉热衣原体可选择４．５、４．６中的技术方法对其进行衣原体的分子鉴定。４．３．５ 鸡胚接种分离鹦鹉热衣原体鸡胚分离的程序主要为：选取１０枚６ｄ～７ｄ龄ＳＰＦ鸡胚，经卵黄囊途径接种０．５ｍＬ接种物，置３９℃湿润环境培养。衣原体感染会使卵黄膜血管呈典型充血，鸡胚在接种后３ｄ～１０ｄ内死亡，如不致死鸡胚，则在确定为阴性之前，再盲传二代。收集鸡胚卵黄膜，用ＳＰＧ缓冲液制成２０％（质量浓度）的悬浮液，收集悬液直接用于鹦鹉热衣原体鉴定或涂片染色。４．４ 组织化学染色技术（改良吉姆兹染色法）４．４．１ 试剂与材料４．４．１．１ Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４·Ｈ２Ｏ。３犛犖／犜２８４６—２０１１４．４．１．２ 亮绿、碱性品红。４．４．１．３ 柠檬酸、冰乙酸、苯酚、无水乙醇、甲醇等有机溶剂。４．４．１．４ 染色液（溶液１～溶液６），配制见附录Ｂ。试验用水符合ＧＢ／Ｔ６６８２规定。４．４．２ 操作步骤４．４．２．１ 压痕涂片染色将病料（肝脏、脾脏等）在洁净的载玻片上压痕涂片甲醇固定５ｍｉｎ溶液３染色１０ｍｉｎ净水冲洗溶液６复染２ｍｉｎ净水冲洗自然晾干显微镜检。４．４．２．２ 石蜡切片染色将病料组织的石蜡切片脱腊，然后与双蒸水水合用溶液３染色１０ｍｉｎ，净水冲洗浸泡在溶液４至红色燃料完全脱出，洁净水冲洗将其在溶液６复染（将切片置复染液内浸染２０次）９５％乙醇处理（选取两个乙醇缸，分别在每个乙醇缸内各浸沾５次）脱水、晾干、固片显微镜检。４．４．３ 结果判定如果在绿色背景镜检测观察抹片或切片会呈现红色，那么检测样品中可初步判定有衣原体。４．５ 荧光犘犆犚检测（狉犲犪犾狋犻犿犲犘犆犚）４．５．１ 原理犐狀犮犃是一种在细菌体内合成并分泌到细菌包涵体膜表面的蛋白分子。该蛋白广泛存在于所有的衣原体中。虽然其核酸序列相对保守，但是在衣原体的不同种之间却具有很大的差异。本方法主要是基于犐狀犮犃基因，设计针对对鹦鹉热衣原体（犆．狆狊犻狋狋犮犻ｓｐｅｃｉｅｓ）的特异性引物和探针，通过ＰＣＲ扩增技术对鹦鹉热衣原体进行分子鉴定。４．５．２ 主要试剂与材料４．５．２．１ 标准阳性鹦鹉热衣原体（由指定单位提供）。４．５．２．２ ＰＣＲ反应预混液：犜犪狇ＭａｎＰＣＲｕｎｉｖｅｒｓａｌｍａｓｔｅｒｍｉｘ（ＡＢＩ公司），也可用其他等效商业试剂盒替代。４．５．２．３ 引物及探针：上游引物序列（Ｆ）：５’ＧＣＣＡＴＣＡＴＧＣＴＴＧＴＴＴＣＧＴＴＴ３’下游引物序列（Ｒ）：５’ＣＧＧＣＧＴＧＣＣＡＣＴＴＧＡＧＡ３’ＭＧＢ犜犪狇Ｍａｎ探针序列：５’ＦＡＭＴＣＡＴＴＧＴＣＡＴＴＡＴＧＧＴＧＡＴＴＣＡＧＧＡＮＦＱＭＧＢ３’４．５．２．４ 各种分子生物学试验常用耗材及化学分析纯试剂。４．５．３ 主要设备４．５．３．１ 高速冷冻离心机、台式离心机。４．５．３．２ 超净工作台。４．５．３．３ 核酸蛋白分析仪。４．５．３．４ 各种规格微量加样器。４．５．３．５ ＰＣＲ反应管。４．５．３．６ 荧光ＰＣＲ仪。４犛犖／犜２８４６—２０１１４．５．４ 操作步骤４．５．４．１ 犇犖犃提取将细胞培养及鸡胚分离的待分析样品采用常规碱裂解法提取ＤＮＡ，也可采用市售的ＤＮＡ提取试剂盒直接提取衣原体ＤＮＡ。４．５．４．２ 犘犆犚反应体系该ＰＣＲ以２５μＬ体系为例，其中包含１２．５μＬ犜犪狇ＭａｎＵｎｉｖｅｒｓａｌＰＣＲｍａｓｔｅｒｍｉｘ、０．３μｍｏｌ／Ｌ的上下游引物、０．２μｍｏｌ／Ｌ的探针、５μＬ纯化的ＤＮＡ模板（２０ｎｇ／μＬ～３０ｎｇ／μＬ），以灭菌蒸馏水补充至２５μＬ。在每次ＰＣＲ扩增反应板中同时设立阳性对照、阴性对照及空白对照。４．５．４．３ 犘犆犚反应参数将如上准备好的ＰＣＲ反应体系置荧光ＰＣＲ仪器（如：ＡＢＩ７５００），热循环条件按以下参数