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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２８５５—２０１１恶性卡他热检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犿犪犾犻犵狀犪狀狋犮犪狋犪狉狉犺犪犾犳犲狏犲狉２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准修改采用国际动物卫生组织（ＯＩＥ）《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（２００９版）中２．４．１５章“恶性卡他热”部分。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局。本标准主要起草人：孙敏、梁成珠、孔繁德、郑小龙、高宏伟、邓明俊、林超、刘彩霞。Ⅰ犛犖／犜２８５５—２０１１恶性卡他热检疫技术规范１ 范围本标准规定了恶性卡他热的临床诊断、病毒分离鉴定、间接荧光抗体试验、免疫过氧化物酶试验、病毒中和试验、竞争抑制酶联免疫吸附试验、聚合酶链反应等检疫方法的技术要求。本标准适用于进出口牛、鹿、猪等多种动物恶性卡他热的检疫和诊断。２ 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法。３ 缩略语下列缩略语适用于本文件。ＭＣＦ（ｍａｌｉｇｎａｎｔｃａｔａｒｒｈａｌｆｅｖｅｒ）：恶性卡他热。ＡＩＨＶ１（ａｌｃｅｌａｐｈｉｎｅｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ１）：狷羚疱疹病毒１型ＯｖＨＶ２（ｏｖｉｎｅｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ２）：绵羊疱疹病毒２型ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ）：磷酸盐缓冲液ＣＰＥ（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃｅｆｆｅｃｔ）：细胞病变效应ＩｇＧ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＧ）：免疫球蛋白ＧＴＣＩＤ５０（５０％ｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅｉｎｆｅｃｔｉｖｅｄｏｓｅ）：半数组织培养感染量ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）：聚合酶链反应ＤＮＡ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）：脱氧核糖核酸ｄＮＴＰ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）：脱氧核糖核苷三磷酸ｄＡＴＰ（ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）：脱氧腺苷三磷酸ｄＣＴＰ（ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）：脱氧胞苷三磷酸ｄＧＴＰ（ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）：脱氧鸟苷三磷酸ｄＴＴＰ（ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）：脱氧胸苷三磷酸ｂｐ（ｂａｓｅｐａｉｒ）：碱基对ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）：异硫氰酸荧光素ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）：二甲基亚砜ＴＢＥ：Ｔｒｉｓ（三羟甲基氨基甲烷）、硼酸、ＥＤＴＡ（乙二胺四乙酸）缓冲液Ｃｔ值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数４ 临床诊断４．１ 临床表现从最急性到慢性型病例，恶性卡他热（ＭＣＦ）的临床症状相差甚远。最急性病例，既无临床症状，也１犛犖／犜２８５５—２０１１无精神沉郁，只在死前１２ｈ～２４ｈ可能出现腹泻和下痢。一般情况下，ＭＣＦ病例症状是伴随着高热逐步出现的，起初眼鼻流液，继之转变为黏脓性分泌物，病畜可能食欲下降，产奶量降低。特征性症状包括：———病畜双眼角膜从外周开始逐渐浑浊；有些病例可在会阴、乳房和乳头部，出现皮肤损害（主要表现为溃疡和渗出），并可形成硬痂（与上皮坏死有关）。口腔充血、流涎，并逐步发展为舌、硬腭和齿龈溃疡，颊乳头糜烂是其典型症状；———浅表淋巴结肿大，四肢关节肿大；———出现感觉过敏、运动失调、眼球震颤等神经症状，在无其他症状时可能出现头颈部僵硬。其他资料参见附录Ａ。４．２ 病理学变化４．２．１ 解剖病理学变化包括：———胃肠道可能有出血和糜烂，急性病例可出现肠道内容物带血；———淋巴结肿大，但程度不一。淋巴结切开时，常见发白、硬化，有些可见颌下淋巴结和咽后淋巴结出血甚至坏死；———呼吸道可见卡他性炎症积液，糜烂和白喉膜生成；———泌尿道膀胱上皮层淤血性出血，肾皮质出现白色小坏死灶，直径约１ｍｍ～５ｍｍ，有时可被一出血带包围。４．２．２ 组织病理学变化：确诊ＭＣＦ的基础。淋巴器官上皮变性，血管炎症、增生乃至坏死，非淋巴器官间质广泛分布淋巴细胞是其特征性变化，如：———所有上皮表面出现溃疡和糜烂，常伴发上皮和上皮内淋巴细胞浸润；———常见大脑血管炎，血管外膜和膜介质出现淋巴细胞浸润，并常见类纤维变性。血管腔内可见淋巴细胞贴壁，重病例可见内皮损伤和内皮下膜淋巴细胞集聚，有时可见血管堵塞；———淋巴结增生以副皮质淋巴样干细胞膨胀为特征，常伴发滤泡退行性病变，淋巴组织炎性水肿常涉及周围组织；———非淋巴组织特别是肾皮质和肝门静脉周围区的间质淋巴细胞集聚明显，脑内可能有非化脓性脑膜炎、脑脊髓炎，伴随淋巴细胞周围的套状白细胞聚集及脑脊髓液中细胞成分增多；———角膜淋巴细胞浸润，从周边逐步向中心发展，随病程延长，发展为水肿和坏死。也可能出现脉管炎、眼前房积脓和虹膜睫状体炎。５ 实验室诊断５．１ 狷羚疱疹病毒１型（犃犐犎犞１型）５．１．１ 病毒分离５．１．１．１ 设备和材料生物安全柜、立式冷冻离心机、倒置光学显微镜、二氧化碳培养箱、高压灭菌锅、蔡氏滤器和微孔滤膜（０．２２μｍ）、细胞瓶、细胞培养板、１５ｍＬ离心管、组织研磨器、微量可调加样器及配套吸头（２０μＬ和２００μＬ）、移液管。细胞：反刍动物源的大多数原代或低代细胞都可用于ＡＩＨＶ１的病毒分离，常用牛甲状腺细胞。５．１．１．２ 试剂ＤＭＥＭ培养基或其他培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素及其他常规试剂，配制方法见附录Ｂ。试２犛犖／犜２８５５—２０１１验用水应符合ＧＢ／Ｔ６６８２要求。５．１．１．３ 操作方法５．１．１．３．１ 样品采集和送检无菌采集动物抗凝全血（使用ＥＤＴＡ作抗凝剂）。对病死动物，立即采集淋巴结、肾上腺、脾、肺等组织，置于冰盒中冷藏保存，尽快送实验室进行处理。５．１．１．３．２ 样品处理５．１．１．３．２．１ 抗凝全血的处理取抗凝血加入２倍～３倍体积红细胞裂解液，混匀静置４ｍｉｎ～５ｍｉｎ，待红细胞完全破碎，１５００犵离心５ｍｉｎ。弃上清液去除红细胞，得到白细胞沉淀（若仍有红细胞，则重复上述步骤）。加入ＰＢＳ缓冲液，制成白细胞悬液，－２０℃保存备用。５．１．１．３．２．２ 动物组织的处理取病料组织５ｇ，剪碎后置于无菌平皿内，加入１０ｍＬ无血清培养液（含青霉素２０００ＩＵ／ｍＬ、链霉素２０００μｇ／ｍＬ），用无菌研槌研磨，制备成组织悬液。３００犵离心１０ｍｉｎ，收取上清液－２０℃保存备用。５．１．１．３．３ 病毒分离将上述细胞悬液的浓度调整至５×１０６个／ｍＬ，接种于制备好的单层细胞培养物上，置５％二氧化碳培养箱，３７℃吸附６０ｍｉｎ。补充适量细胞维持液继续培养，３６ｈ～４８ｈ后换液一次，以后每２ｄ～３ｄ换液一次。培养过程中每日观察细胞病变（ＣＰＥ）情况，连续观察２１ｄ。特征变化是：单细胞层内出现多核灶，并逐渐收缩形成带有胞质突的聚集体，聚集体最终脱离。如果不出现ＣＰＥ，应盲传二次，即将细胞培养物冻融两次，再接种到单层细胞培养。盲传两代，无ＣＰＥ，则判为阴性。以不接种样品的细胞培养物作为阴性对照。５．１．１．３．４ 分离物鉴定使用特异性血清或单克隆抗体，采用免疫荧光或免疫细胞化学技术对分离物进行鉴定。５．１．２ 间接荧光抗体实验（犐犉犃）５．１．２．１ 设备和材料荧光显微镜、二氧化碳培养箱、电热恒温水浴箱、超低温冰箱、立式冷冻离心机、台式离心机、微量可调加样器及配套吸头（２０μＬ和２００μＬ）、多孔载玻片、盖玻片、１．５ｍＬ和１５ｍＬ离心管。细胞：牛鼻甲细胞。５．１．２．２ 试剂ＤＭＥＭ培养基、胎牛血清、ＰＢＳ、胰蛋白酶、ＥＤＴＡ、伊文思兰、兔抗牛荧光抗体、甘油，配制方法见附录Ｂ。５．１．２．３ 操作方法５．１．２．３．１ 抗原片的制备５．１．２．３．１．１ 用１０％胎牛血清ＤＭＥＭ细胞生长液在细胞瓶中培养牛鼻甲细胞。３犛犖／犜２８５５—２０１１５．１．２．３．１．２ 待细胞长成单层后，弃去瓶中的细胞培养液，加入２％胎牛血清ＤＭＥＭ细胞维持液，接种ＡＩＨＶ１病毒（ＷＣ１１株），放入３７℃二氧化碳培养箱培养２ｄ～４ｄ。在培养带毒细胞的同时，培养部分正常细胞。５．１．２．３．１．３ 每天观察细胞病变，待细胞病变即将出现又未出现时，弃去培养基，用ＰＢＳ洗１次。５．１．２．３．１．４ 在细胞瓶中加入５ｍＬ胰蛋白酶ＥＤＴＡ细胞消化液消化细胞，待细胞完全变圆，倒掉消化液。５．１．２．３．１．５ 用ＰＢＳ将脱落的细胞用移液管移到１５ｍＬ离心管中，８００犵离心５ｍｉｎ，弃上清液。加入ＰＢＳ洗涤细胞１次后，用ＰＢＳ将细胞重悬。５．１．２．３．１．６ 用ＰＢＳ调整细胞浓度，调至细胞悬液滴加至多孔载玻片上为单层，不重叠为最佳。５．１．２．３．１．７ 用２００μＬ加样器滴加病变细胞于多孔载玻片上，同时设置正常细胞对照孔，风干。丙酮固定１０ｍｉｎ，干燥，－７０℃保存备用。５．１．２．３．２ 抗体检测５．１．２．３．２．１ 用１０％牛血清（ＰＢＳ稀释）封闭抗原片，即用１０％牛血清滴加所有细胞孔，包括正常细胞孔和感染细胞孔，滴加好的玻片马上放入湿盒内（盒内垫有湿纱布），３７℃孵育３０ｍｉｎ。５．１．２．３．２．２ 取出玻片，用ＰＢＳ洗３次，每次浸泡２ｍｉｎ。５．１．２．３．２．３ 将玻片晾干，滴加１∶２０稀释的待检血清，每个样本滴加２个孔，即１孔正常细胞，１孔感染细胞，同时设阳性血清对照和阴性血清对照，滴加时应避免相互交叉串孔，置３７℃湿盒内孵育３０ｍｉｎ。５．１．２．３．２．４ 取出玻片，用ＰＢＳ洗３次，每次浸泡５ｍｉｎ，其间轻轻振摇数次。５．１．２．３．２．５ 取出玻片晾干，滴加稀释好的兔抗牛ＦＩＴＣ荧光结合物，置于３７℃湿盒内孵育３０ｍｉｎ。５．１．２．３．２．６ 取出玻片，用ＰＢＳ漂洗３次，每次浸泡５ｍｉｎ，其间轻轻振摇数次。５．１．２．３．２．７ 用１／１０４伊文思兰复染３０ｓ，ＰＢＳ洗涤２ｍｉｎ。玻片用蒸馏水漂洗２次，再用ＰＢＳ／甘油（５０／５０）封片，在荧光显微镜下观察结果。５．１．２．３．２．８ 结果判定：正常细胞孔细胞无荧光反应，滴加阳性血清的感染细胞孔细胞有荧光反应，滴加阴性血清的感染细胞孔细胞无荧光反应，即可判定结果。待检血清的感染细胞孔细胞无荧光反应判为阴性，感染细胞的细胞核、细胞浆有荧光反应者判为阳性。５．１．３ 免疫过氧化物酶试验（犐犘犜）５．１．３．１ 设备和材料光学显微镜、二氧化碳培养箱、电热恒温水浴箱、超低温冰箱、立式冷冻离心机、台式离心机、微量可调加样器及配套吸头（１ｍＬ和２００μＬ）、莱顿试管、４格玻片、１．５ｍＬ和１５ｍＬ离心管。细胞：牛鼻甲细胞。５．１．３．２ 试剂ＤＭＥＭ培养基、胎牛血清、ＰＢＳ、胰蛋白酶、过氧化物酶标记的抗牛ＩｇＧ、甘油、吐温２０、ＡＥＣ底物（３氨基９乙基咔唑），配制方法见附录Ｂ。５．１．３．３ 操作方法５．１．３．３．１ 抗原片的制备５．１．３．３．１．１ 在内置盖玻片的莱顿试管或４格玻片上，用１０％胎牛血清ＤＭＥＭ细胞生长液培养牛鼻甲细胞。４犛犖／犜２８５５—２０１１５．１．３．３．１．２ 待细胞长成单层后，弃去细胞培养液，将病毒稀释成１０３ＴＣＩＤ５０（病毒滴定同５．１．４．３．１．２），接种至莱顿试管，每管１．６ｍＬ，或接种至４格玻片内，每格１ｍＬ。同时设置正常细胞对照。５．１．３．３．１．３ 观察细胞病变，当ＣＰＥ出现时，丙酮固定１０ｍｉｎ，干燥，－７０℃保存备用。５．１．３．３．２ 抗体检测５．１．３．３．２．１ 用ＩＰＴ稀释液将待检血清１∶２０稀释，在固定好的病毒感染盖片或玻片格上滴加稀释血清１５０μＬ～２００μＬ，滴加好的玻片置３７℃湿盒内孵育３０ｍｉｎ。同时设置阴性血清和阳性血清对照。５