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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２７７２—２０１１国境口岸蚊媒中日本脑炎病毒快速检测方法犚犪狆犻犱犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犑犪狆犪狀犲狊犲犲狀犮犲狆犺犪犾犻狋犻狊狏犻狉狌狊犳狉狅犿犿狅狊狇狌犻狋狅犲狊犪狋犳狉狅狀狋犻犲狉狆狅狉狋２０１１０２２５发布２０１１０７０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国湖北出入境检验检疫局。本标准主要起草人：胡孔新、王汉华、杨鹏飞、平芮巾、孙肖红、杨宇、王静、张乐。Ⅰ犛犖／犜２７７２—２０１１国境口岸蚊媒中日本脑炎病毒快速检测方法１ 范围本标准规定了国境口岸蚊媒中日本脑炎病毒快速检测方法，包括样本抗原和核酸快速检验鉴定方法及检测结果的分析与判读。本标准适用于对国境口岸蚊类携带的日本脑炎病毒的检测。２ 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ１９４８９ 实验室 生物安全通用要求ＳＮ／Ｔ１５５２ 国境口岸生物因子恐怖事件监测规程ＳＮ／Ｔ２３００—２００９ 国境口岸蚊类携带基孔肯雅病毒的检测方法ＷＳ２１４ 流行性乙型脑炎诊断标准及处理原则ＷＳ２３３ 微生物和生物医学实验室生物安全通用准则可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定（卫生部，２００６年１月１１日）３ 术语与定义下列术语和定义适用于本文件。３．１日本脑炎 犑犪狆犪狀犲狊犲犲狀犮犲狆犺犪犾犻狋犻狊由日本脑炎病毒引起、由蚊传播的中枢神经系统急性传染病，也称流行性乙型脑炎。临床上以突然起病，高热、头痛、呕吐、嗜睡或昏迷、惊厥为特征。４ 检测对象入出境交通工具、运输设备、货物、行李、邮包等藏匿和捕获的及口岸区域捕获的蚊虫。５ 实验室生物安全要求实验室生物安全要求按照ＧＢ１９４８９、ＷＳ２３３和ＳＮ／Ｔ１５５２执行。６ 样本采集、处理与转运样本采集、处理与转运参见ＷＳ２１４、ＳＮ／Ｔ２３００—２００９中第７章和附录Ｂ以及可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定执行。１犛犖／犜２７７２—２０１１７ 胶体金免疫层析法检测日本脑炎病毒抗原７．１ 主要仪器７．１．１ 生物安全柜。７．１．２ 可调式微量加样器及塑料尖吸头。７．１．３ 液氮运输罐、液氮储存罐。７．１．４ 普通冰箱、超低温冰箱（－８０℃）。７．１．５ 玻璃研磨器、研磨棒。７．２ 主要试剂及其制备７．２．１ ２５狀犿胶体金的制备取１００ｍＬ双蒸水，加热至沸腾。加入１ｍＬ新鲜制备的１％的氯金酸溶液加速搅拌，同时加入新配置的１％的柠檬酸钠溶液１．５ｍＬ，加热２０ｍｉｎ直到溶液变成酒红色后冷却，４℃避光保存。７．２．２ 免疫层析试纸制备７．２．２．１ 兔抗日本脑炎病毒ＮＳ１蛋白多克隆抗体标记结束的胶体金溶液以ｐＨ为８．２的０．０１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ溶液（含１％ＢＳＡ，５％蔗糖）重悬，浸湿结合垫后３７℃干燥２ｈ。７．２．２．２ 以浓度为２ｍｇ／ｍＬ的日本脑炎全病毒鼠免疫多克隆抗体在硝酸纤维素膜上划线作为检测带。７．２．２．３ 以浓度为１ｍｇ／ｍＬ的羊抗兔ＩｇＧ在硝酸纤维素膜上划线作为质控线，参数０．１μＬ／ｍｍ划线，检测线与质控线间距离约为７ｍｍ。７．２．２．４ 将吸收垫、样品垫及处理后的结合垫、硝酸纤维素膜叠加，组装成完整的层析条，然后切割层析条，宽度每条４ｍｍ，干燥避光保存待用。７．２．３ 狆犎为８．２的０．０１犿狅犾／犔犜狉犻狊溶液５０ｍＬ的０．１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ溶液与２２．９ｍＬ的０．１ｍｏｌ／Ｌ盐酸混匀后，加双蒸水稀释至１００ｍＬ，混匀后将上述溶液与双蒸水按１∶４稀释即为ｐＨ８．２的０．０１ｍｏｌ／Ｌ的Ｔｒｉｓ溶液。７．２．４ 狆犎为８．０的５犿犿狅犾／犔犘犅溶液称取磷酸二氢钠２７．８ｇ加双蒸水至１０００ｍＬ溶解即为０．２ｍｏｌ／Ｌ的磷酸二氢钠溶液；称取磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４·７Ｈ２Ｏ）５３．６ｇ加双蒸水至１０００ｍＬ溶解即为０．２ｍｏｌ／Ｌ磷酸氢二钠溶液。取０．２ｍｏｌ／Ｌ的磷酸二氢钠溶液５．３ｍＬ，取０．２ｍｏｌ／Ｌ磷酸氢二钠溶液９４．７ｍＬ混匀后加双蒸水按１∶１９稀释即可。７．２．５ 样本处理液ｐＨ为８．０含１％ＮＰ４０的５ｍｍｏｌ／ＬＰＢ溶液。７．３ 检测步骤７．３．１ 将免疫胶体金试剂盒内的检测卡、样本处理液等置于室温下平衡。７．３．２ 液氮研磨蚊媒组织成粉末状后加适量（５０只批次可加入１ｍＬ）的ｐＨ为８．０的５ｍｍｏｌ／ＬＰＢ液重悬，混匀后于４℃，８０００犵离心５ｍｉｎ，取上清液，即为蚊媒悬液。２犛犖／犜２７７２—２０１１７．３．３ 取蚊媒组织悬液４００μＬ，用滴管或加样器滴加样本处理液４００μＬ，混匀后从试管中取２滴～３滴或８０μＬ～１００μＬ样品滴加于样品孔内。７．３．４ 结果应在１５ｍｉｎ内观察，阳性结果最早１ｍｉｎ～２ｍｉｎ即可显示出来，但阴性结果应在１５ｍｉｎ后才可判定。７．４ 结果判断７．４．１ 当层析观测窗“Ｃ”（对照）处未出现条状红色沉淀线，则无论层析观测窗“Ｔ”（检测）处是否有显示均为无效，应重新检测。７．４．２ 当层析观测窗只有“Ｃ”（对照）处出现１条红色沉淀线，而“Ｔ”（检测）处无红色沉淀线，报告为检测结果阴性，即没有检出日本脑炎病毒抗原。７．４．３ 当层析观测窗“Ｃ”（对照）处和“Ｔ”（检测）处出现２条红色沉淀线，报告为检测结果阳性，即检出日本脑炎病毒抗原。７．４．４ 结果示意见图１。犪） 阳性 犫） 阴性犮） 无效 犱） 无效图１ 免疫层析法检测日本脑炎病毒抗原的结果示意图８ 日本脑炎病毒核酸反转录聚合酶链反应（犚犜犘犆犚）检测８．１ 主要仪器８．１．１ ＰＣＲ扩增仪。８．１．２ 低温高速台式离心机。８．１．３ 电泳仪及电泳槽等。８．１．４ 凝胶成像分析系统仪或紫外投射仪。８．１．５ 微型混合器、涡旋振荡器。８．１．６ 可调式微量加样器及塑料尖吸头。８．１．７ 恒温水浴箱。８．１．８ 生物安全柜。８．１．９ 超净工作台。８．１．１０ 高压灭菌锅。８．２ 主要试剂除另有规定外，所有试剂均采用分析纯。３犛犖／犜２７７２—２０１１８．２．１ 核酸提取试剂：用美国Ｑｉａｇｅｎ公司ＱＩＡａｍｐＶｉｒａｌＲＮＡＫｉｔ提取病毒核酸１）。８．２．２ 反转录试剂：用美国ｐｒｏｍｅｇａ公司的Ａ３５００反转录试剂盒ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭⅡＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅＳｙｓｔｅｍｓ２）。８．２．３ ＰＣＲ扩增试剂：用美国ｐｒｏｍｅｇａ公司的Ｍ５６６１核酸扩增试剂盒ＧｏＴａｑ?ＨｏｔＳｔａｒｔＣｏＬｏｒＬｅｓｓＭａｓｔｅｒＭｉｘ３）。１）、２）、３） 为美国公司提供产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。８．２．４ ＤＮＡＬａｄｄｅｒ（１００ｂｐ～２０００ｂｐ）或类似范围的商品化ＤＮＡｍａｒｋｅｒ。８．２．５ ＲＴＰＣＲ检测的引物见表１。表１ 日本脑炎病毒检测的犘犆犚引物引物序列（５’～３’）位置片段随机六聚休ＪＳ３１ＦＪＳ３１ＲＮＮＮＮＮＮＡＧＡＧＣＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＴＣＡＴＴＴＴＣＡＣＧＣＴＣＴＴＴＣＴＡＣＡＧＴ—５７３９５７５８５９００５８８１１６２ｂｐ８．３ 检测步骤８．３．１ 核酸提取８．３．１．１ 吸取１４０μＬ样本处理液加入溶解的裂解液ＡＶＬ。８．３．１．２ 脉冲混匀１５ｓ，置于室温１０ｍｉｎ。８．３．１．３ 短暂离心，加入５６０μＬ无水乙醇（９６％～１００％）脉冲混匀１５ｓ。８．３．１．４ 短暂离心。８．３．１．５ 将ＱＩＡａｍｐ旋转柱置于２ｍＬ收集管中。从步骤８．３．１．３中吸取６３０μＬ溶液转移至旋转柱上，６０００犵离心１ｍｉｎ，将旋转柱放至干净的收集管上，丢弃包含过滤液的收集管。８．３．１．６ 打开旋转柱盖，重复步骤８．３．１．５。８．３．１．７ 打开旋转柱盖，加入５００μＬ洗液ＡＷ１，盖紧盖子，６０００犵离心１ｍｉｎ。将旋转柱放至干净的收集管上，丢弃包含过滤液的收集管。８．３．１．８ 打开旋转柱盖，加入５００μＬ洗液ＡＷ２，盖紧盖子，２００００犵离心３ｍｉｎ。将旋转柱放至干净的收集管上，２００００犵再离心１ｍｉｎ。将旋转柱放至干净的１．５ｍＬ离心管上，丢弃包含过滤液的收集管。８．３．１．９ 打开旋转柱盖，加入６０μＬ室温平衡的缓冲液ＡＶＥ。８．３．１．１０ 盖紧盖子，室温放置１ｍｉｎ。８．３．１．１１ ６０００犵离心１ｍｉｎ。８．３．１．１２ 收集滤出液，用于ＲＴＰＣＲ扩增。－７０℃储存ＲＮＡ。８．３．２ 犚犜犘犆犚检测８．３．２．１ 反转录：取上述总ＲＮＡ５μＬ放入ＰＣＲ管中，加入２μＬ随机六聚体引物（１０ｐｍｏｌ／μＬ），７０℃变性５ｍｉｎ后迅速放入冰浴中退火杂交，然后依次加入２μＬ４×ｄＮＴＰｓ、４μＬ的１０ｍｍｏｌ／ＬＡＭＶ逆转录酶缓冲液、０．５μＬＲＮａｓｉｎ、１μＬＭｇＣｌ２（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）、１μＬＡＭＶ逆转录酶，无ＲＮＡ酶的ＤＥＰＣ水补足２０μＬ。将以上混合体系混合，４２℃作用４５ｍｉｎ，７２℃１０ｍｉｎ灭活。８．３．２．２ 扩增反应体系：取５μＬ上述合成的ｃＤＮＡ为模板，依次加入２５μＬＭａｓｔｅｒＭｉｘ、上游和下游４犛犖／犜２７７２—２０１１引物（见表１）各２μＬ、０．５μＬ犜犪狇ＤＮＡ聚合酶，以无ＲＮＡ酶的ＤＥＰＣ水补足５０μＬ的反应体系，稍加离心后，放入ＰＣＲ扩增仪。８．３．２．３ 扩增反应条件：９４℃预变性１ｍｉｎ然后进入循环９４℃３０ｓ；５０℃３０ｓ；７２℃２ｍｉｎ，共３０个循环，最后７２℃，延伸１０ｍｉｎ。８．３．３ 凝胶电泳ＰＣＲ扩增产物，经１．０％的琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像系统照相记录结果。８．４ 结果判定８．４．１ 质量控制反应结果同时符合以下两个条件，否则实验结果无效：———阴性对照未出现特异性条带；———阳性对照出现预期１６２ｂｐ大小的扩增条带。８．４．２ 结果分析在实验结果有效情况下，如待测样本出现预期１６２ｂｐ大小的扩增条带，则可初步判断待测样本为日本脑炎病毒ＮＳ３基因阳性；如待检样本扩增产物在１６２ｂｐ处没有出现条带，则可初步判断待测样本为日本脑炎病毒ＮＳ３基因阴性。８．４．３ 测序（可选择）切下目的条带，用凝胶回收试剂盒回收（按其说明书进行），自动测序仪测序，确认病毒基因，也可进一步分析病毒基因的变异情况。９ 阳性结果的处理对阳性结果的相应标本应送相关的实验室进行进一步复检和鉴定。阳性结果应按规定向上级主管部门报告。５犛犖／犜２７７２—２０１１书书书１１０２—２７７２犜／犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准国境口岸蚊媒中日本脑炎病毒快速检测方法ＳＮ／Ｔ２７７２—２０１１中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６ ６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６ 印张０．７５ 字数１１千字２０１１年６月第一版 ２０１１年６月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２２０５４ 定价１６．００元