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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２７７４—２０１１国境口岸鼠疫耶尔森菌蛋白悬浮芯片检测方法犇犲狋犲犮狋犻狅狀犿犲狋犺狅犱犳狅狉犢犲狉狊犻狀犻犪狆犲狊狋犻狊犫狔狆狉狅狋犲犻狀狊狌狊狆犲狀狊犻狅狀犪狉狉犪狔犪狋犳狉狅狀狋犻犲狉狆狅狉狋２０１１０２２５发布２０１１０７０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：王静、孙肖红、杨宇、杨永莉、胡孔新、文海燕。Ⅰ犛犖／犜２７７４—２０１１国境口岸鼠疫耶尔森菌蛋白悬浮芯片检测方法１ 范围本标准规定了国境口岸可疑物品或环境样品中鼠疫耶尔森菌的蛋白悬浮芯片检测方法，包括样品处理、检测方法、结果判定及报告。本标准适用于国境口岸可疑物品或环境样品中鼠疫耶尔森菌的实验室检验。２ 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ１９４８９ 实验室 生物安全通用要求人间传染的病原微生物名录（卫生部，２００６年）３ 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１鼠疫耶尔森菌 犢犲狉狊犻狀犻犪狆犲狊狋犻狊鼠疫菌为耶尔森菌属由假结核菌进化而来的新生病原体，革兰氏染色阴性、不运动、不形成芽孢的球杆菌，能够引发腺鼠疫、败血型鼠疫和肺鼠疫，是生物战剂和生物恐怖的重要病原菌之一。３．２鼠疫耶尔森菌犉１抗原 犢犲狉狊犻狀犻犪狆犲狊狋犻狊犉１犪狀狋犻犵犲狀Ｆ１抗原是鼠疫菌的荚膜抗原，是鼠疫菌于３７℃条件下在细胞壁外形成的一层厚凝胶状荚膜，是鼠疫菌主要的保护性抗原。人或动物感染鼠疫菌后，Ｆ１抗原在体内高度表达，具有明显抗吞噬和活化补体的作用。鼠疫菌Ｆ１抗原具有抗原性强、特异性高等特点，检测Ｆ１抗原及其抗体是鼠疫诊断的重要依据，也是目前公认的鼠疫菌种特异性抗原之一。３．３蛋白悬浮芯片 狆狉狅狋犲犻狀狊狌狊狆犲狀狊犻狅狀犪狉狉犪狔利用带编码的包覆荧光发色剂的微球为载体标定目标抗原或抗体，以报告分子（如：荧光染料）标记目标抗原或抗体，流式细胞仪作为检测平台，可以对抗原或抗体等生物分子进行大规模检测的一种生物芯片技术。４ 仪器设备悬浮芯片系统１）、微孔滤板抽滤器、真空气泵、恒温振荡器、生物安全柜、离心机、荧光显微镜、超声波清洗器、恒温培养箱、纯水机、漩涡混合仪、血球计数板。１） Ｌｕｍｉｎｅｘ１００／２００或等效设备。１犛犖／犜２７７４—２０１１５ 主要试剂与耗材５．１ 试剂生物素标记试剂盒：ＢｉｏｔｉｎＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔＳＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）２）或等效试剂盒，微球交联试剂盒：ＡｍｉｎｅＣｏｕｐｌｉｎｇＫｉｔ（ＢｉｏＲａｄ）３）或等效试剂盒，悬浮芯片仪校准试剂盒：ＢｉｏＰｌｅｘＣａｌｉｂｒａｔｉｏｎＫｉｔ（ＢｉｏＲａｄ）４）或等效试剂盒，悬浮芯片仪校验试剂盒：ＢｉｏＰｌｅｘＶａｌｉｄａｔｉｏｎＫｉｔ（ＢｉｏＲａｄ）５）或等效试剂盒６），兔抗鼠疫菌Ｆ１抗原抗体（或等效抗体），鼠疫Ｆ１抗原单抗２Ｆ６（或等效抗体），藻红蛋白标记链霉亲和素（ＳＡＰＥ），１（３二甲氨基丙基）３乙基碳二亚胺盐酸盐（ＥＤＣ），牛血清白蛋白（ＢＳＡ），犖羟基硫代琥珀酰亚胺（ＳｕｌｆｏＮＨＳ），鸡ＩｇＧ，兔抗鸡ＩｇＧ，羊抗兔ＩｇＧ，吐温２０。其他所需缓冲溶液配制及要求参见附录Ａ。２）、３）、４）、５）、６） 由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本文件的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。５．２ 耗材羧基化编码微球、９６孔滤板、消毒液：１０％的次氯酸钠溶液（含有效氯＞１０％）、悬浮芯片仪样品流路鞘液。６ 抗体包被编码微球和生物素标记抗体６．１ 活化编码微球６．１．１ 取１００μＬ编码微球到１．５ｍＬ离心管中，１４０００犵离心４ｍｉｎ，小心吸出上清液并弃去。６．１．２ 加入１００μＬ的微球清洗缓冲液悬浮，振荡３０ｓ，超声３０ｓ，１４０００犵离心４ｍｉｎ，小心吸出上清液并弃去。６．１．３ 加入１００μＬ的微球活化缓冲液，然后先加入１０μＬ新鲜配制的ＥＤＣ工作液，再加入１０μＬ新鲜配制的ＳｕｌｆｏＮＨＳ工作液，高速振荡３０ｓ后用铝箔包裹，在室温１８℃～２５℃振摇２０ｍｉｎ。６．１．４ 加入１５０μＬ的ＰＢＳ（ｐＨ７．４），振荡１０ｓ后，１４０００犵离心４ｍｉｎ，小心吸出上清液并弃去。６．１．５ 重复６．１．４步骤一次。６．１．６ 加入１００μＬ的ＰＢＳ（ｐＨ７．４）悬浮编码微球，中速振荡３０ｓ后，超声１５ｓ。６．２ 抗体包被编码微球６．２．１ 取溶于０．０３ｍｏｌ／ＬＰＢ缓冲液（ｐＨ７．２）兔抗Ｆ１抗体１２μｇ加入到活化后的编码微球中，用ＰＢＳ（ｐＨ７．４）定容至５００μＬ，铝箔包裹在室温１８℃～２５℃振摇２ｈ。然后，１４０００犵离心４ｍｉｎ，小心吸出上清液并弃去。６．２．２ 加入５００μＬ的ＰＢＳ（ｐＨ７．４），振荡混匀，１４０００犵离心４ｍｉｎ，小心吸出上清液并弃去。６．２．３ 加入２５０μＬ微球封闭缓冲液悬浮编码微球，中速振荡１５ｓ，用铝箔包裹，在室温１８℃～２５℃振摇３０ｍｉｎ，１４０００犵离心４ｍｉｎ，小心吸出上清液并弃去。６．２．４ 加入５００μＬ微球保存液洗涤编码微球，１６０００犵离心６ｍｉｎ，小心吸出上清液并弃去。６．２．５ 用１５０μＬ的微球保存液悬浮编码微球，于０℃～４℃避光保存备用，有效期１年。６．３ 包被微球的计数吸取适量微球，稀释后，用血球计数板（０．１０ｍｍ；１／４００ｍｍ２）在显微镜下计数，计算见式（１）：２犛犖／犜２７７４—２０１１微球数量＝４个大格平均数×１０４×稀释倍数×体积（ｍＬ）………………（１） 记录微球数量。包被微球是否成功见Ｂ．１。６．４ 生物素标记抗体６．４．１ 将生物素从冰箱取出，平衡至室温１８℃～２５℃。６．４．２ 分别配制浓度为１０ｍｍｏｌ／Ｌ生物素溶液（超纯水配制）和２ｍｇ／ｍＬ单抗２Ｆ６溶液（ＰＢＳ配制）。６．４．３ 按照每１ｍＬ单抗２Ｆ６溶液加入２７μＬ生物素进行标记，室温１８℃～２５℃振摇３０ｍｉｎ（或冰上２ｈ），经ＨｉＴｒａｐｄｅｓａｌｔｉｎｇ脱盐柱，－２０℃冻存备用有效期１年。６．４．４ 生物素标记抗体是否成功参见Ｂ．２。７ 样品的悬浮芯片检测７．１ 样品处理将可疑样品按照０．１ｇ／ｍＬ加入样品稀释液中，在漩涡振荡器上振荡溶解后，将样品悬液１０００犵低速离心４ｍｉｎ（或滤纸过滤），所得上清液（或滤液）可直接进行悬浮芯片分析检测。７．２ 检测方法７．２．１ 总则：采用双抗体夹心免疫学检测模式，检测过程中全部反应均在９６孔滤板上进行。７．２．２ 用微球稀释液将包被好的微球（６．３）稀释至每微升７０个～１００个微球。７．２．３ 以１００μＬ检测缓冲液润湿滤板，将滤板置于微孔滤板吸滤器，打开真空气泵气抽去所有液体进行抽滤，再将滤板放在干净的纸巾上，完全吸去所有液体。７．２．４ 每孔加入７．２．２的微球稀释液５０μＬ（含微球３５００个～５０００个），真空泵抽滤后，加入１００μＬ微球清洗缓冲液洗涤并用真空泵抽滤，洗涤进行２次。７．２．５ 每孔加入５０μＬ检测样品，并设空白对照３孔，混匀后２５℃避光振摇３０ｍｉｎ，真空泵抽滤后，加入１００μＬ微球清洗缓冲液洗涤并抽滤，洗涤进行３次。７．２．６ 每孔加入５０μＬ生物素化单抗２Ｆ６溶液，混匀后２５℃避光振摇３０ｍｉｎ，真空泵抽滤后，加入１００μＬ微球清洗缓冲液洗涤并真空泵抽滤，洗涤进行３次。７．２．７ 每孔加入５０μＬ检测缓冲液稀释的ＳＡＰＥ（含ＳＡＰＥ４ｎｇ），混匀后２５℃避光振摇１０ｍｉｎ，真空泵抽滤后，加入１００μＬ微球清洗缓冲液洗涤并真空泵抽滤，洗涤进行３次。７．２．８ 每孔加入１２５μＬ检测缓冲液，经振荡使微球重悬。７．２．９ 用悬浮芯片系统读取ＭＦＩ数值并分析数据。注：每次用真空泵抽滤完后，用不同干净纸巾完全吸去液体，以避免交叉污染。８ 结果判断８．１ 犆狌狋狅犳犳值３个空白对照的检测均值与３倍标准差之和。其中，标准差由３个空白对照检测值计算得出。８．２ 质量控制反应结果应同时符合以下４个条件，否则实验结果无效：ａ） ＢＳＡ包被微球作为阴性质控，检测荧光值低于Ｃｕｔｏｆｆ值；ｂ） ＳＡＰＥ包被微球作为荧光质控，检测荧光值远大于Ｃｕｔｏｆｆ值（大于１００倍）；３犛犖／犜２７７４—２０１１ｃ） 生物素化的ＢＳＡ包被微球作为偶联质控，检测荧光值远大于Ｃｕｔｏｆｆ值；ｄ） 鸡ＩｇＧ包被微球和生物素化兔抗鸡ＩｇＧ的组合作为抗体质控（反应过程质控），检测荧光值远大于Ｃｕｔｏｆｆ值。８．３ 结果分析及报告８．３．１ 阳性检测样品荧光值远大于Ｃｕｔｏｆｆ值（２倍以上），报告为鼠疫耶尔森菌蛋白悬浮芯片检测阳性。若检测结果处于灰度区间（Ｃｕｔｏｆｆ值的１倍～２倍），应重做，若重做结果远大于Ｃｕｔｏｆｆ值，则报告为鼠疫耶尔森菌蛋白悬浮芯片检测阳性；若检测结果仍处于灰度区间则报告为鼠疫耶尔森菌蛋白悬浮芯片检测弱阳性，应使用其他方法进行验证。８．３．２ 阴性检测样品荧光值小于Ｃｕｔｏｆｆ值，报告为鼠疫耶尔森菌蛋白悬浮芯片检测阴性。９ 生物安全防护９．１ 根据《人间传染的病原微生物名录》的要求，本实验应在生物安全２级实验室中进行。９．２ 做好个人防护。实验操作时穿戴防护设备，如手套、实验服、口罩。９．３ 使用过的实验用品应遵照ＧＢ１９４８９的要求，对废弃物应进行无害化处理。４犛犖／犜２７７４—２０１１附 录 犃（资料性附录）试剂的配制犃．１ ０．０３犿狅犾／犔犘犅缓冲液（狆犎７．２）用８００ｍＬ纯水溶解２．８３ｇ磷酸氢二钠，１．３６ｇ磷酸二氢钾，用盐酸调节溶液的ｐＨ值至７．２，加纯水至１Ｌ。犃．２ 样品稀释液０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢ，ｐＨ７．２，用０．０３ｍｏｌ／ＬＰＢ缓冲液稀释而成。犃．３ 犘犅犛（狆犎７．４）缓冲液氯化钠１３７ｍｍｏｌ／Ｌ；氯化钾２．７ｍｍｏｌ／Ｌ；磷酸氢二钠１０ｍｍｏｌ／Ｌ；磷酸二氢钾２ｍｍｏｌ／Ｌ。用８００ｍＬ纯水溶解８ｇ氯化钠，０．２ｇ氯化钾，１．４４ｇ磷酸氢二钠和０．２４ｇ磷酸二氢钾。用盐酸调节溶液的ｐＨ值至７．４，加纯水至１Ｌ。分装后在１２１℃高压蒸汽２０ｍｉｎ，或过滤除菌，保存于室温。犃．４ 微球清洗缓冲液ＰＢＳ（ｐＨ７．４），０．０５％吐温２０。犃．５ 微球活化缓冲液１００犿犿狅犾／犔磷酸二氢钠３ｇ磷酸二氢钠，５ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠１．５ｍＬ，定容于２５０ｍＬ，ｐＨ６．２。犃．６ 微球保存液ＰＢＳ，０．１％ＢＳＡ，０．０２％吐温２０，０．０５％Ａｚｉｄｅ，ｐＨ７．４。犃．７ 微球封闭液ＰＢＳ，１％ＢＳＡ，０．０５％Ａｚｉｄｅ，ｐＨ７．４。犃．８ 检测缓冲液ＰＢＳ，１％ＢＳＡ，ｐＨ７．４。犃．９ 微球稀释液ＰＢＳ，１％ＢＳＡ，ｐＨ７．４。５犛犖／犜２７７４—２０１１犃．１０ 犈犇犆工作液５０ｍｇ／ｍＬ，纯水配制（现配现用）。犃．１１ 犛狌犾犳狅犖犎犛工作液５０ｍｇ／ｍＬ，纯水配制（现用现配）。犃．１２ 水本标准所使用水均为纯水机过滤后的去离子水。６犛犖／犜２７７４—２０１１附 录 犅（规范性附录）实验过程的质控犅．１ 包被微球的质控犅．１．１ 用旋涡混合仪充分振荡包被好的微球，使微球均匀分散开来（避光储存在４℃）。犅．１．２ 用微球稀释液将包被好的微球稀释至每微升７０个～１００个微球。犅．１．３ 按１∶２５０稀释生物素标记抗原或抗体（与微球上包被的特异性结合）。犅．１．４ 以１００μＬ检测缓冲液润湿滤板，将滤板置于微孔滤板吸滤器，打开真空气泵气抽去所有液体进行抽滤，再将板放在干净的纸巾上，完全吸去所有液体。犅．１．５ 每孔加入Ｂ．１．２的微球稀释液５０μＬ（含３５００个～５０００个微球），加入裸珠（没有包被的微球）５０μＬ（含３５０