搜索
书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２７５６—２０１１丁香疫霉菌检疫鉴定方法犐狀狊狆犲犮狋犻狅狀犪狀犱犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犘犺狔狋狅狆犺狋犺狅狉犪狊狔狉犻狀犵犪犲（犅犲狉犽．）犓犾犲犫２０１１０２２５发布２０１１０７０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准丁香疫霉菌检疫鉴定方法ＳＮ／Ｔ２７５６—２０１１中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６ ６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６ 印张０．７５ 字数１７千字２０１１年６月第一版 ２０１１年６月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２２１３２ 定价１６．００元书书书前 言 本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：王英超、厉艳、吴品珊、邵秀玲、张京萱、余冬冬、甘琴华、宋涛。Ⅰ犛犖／犜２７５６—２０１１丁香疫霉菌检疫鉴定方法１ 范围本标准规定了进出境植物检疫中丁香疫霉菌检疫鉴定方法。本标准适用于丁香疫霉菌的寄主植物以及寄主植物中夹带土壤中的丁香疫霉菌的鉴定。２ 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ１８０８５—２０００ 小麦矮化腥黑穗病菌检疫鉴定方法３ 原理３．１ 分类学地位丁香疫霉菌［犘犺狔狋狅狆犺狋犺狅狉犪狊狔狉犻狀犵犪犲（Ｂｅｒｋ．）Ｋｌｅｂ．１９０９］属藻菌界（Ｃｈｒｏｍｉｓｔａ），卵菌门（Ｏｏｍｙｃｏｔａ），腐霉目（Ｐｙｔｈｉａｌｅｓ），腐霉科（Ｐｙｔｈｉａｃｅａｅ），疫霉属（犘犺狔狋狅狆犺狋犺狅狉犪）。可引起寄主的根、茎、叶、果实的多种病害，如丁香的枝枯病（ｔｗｉｇｂｌｉｇｈｔ），苹果和梨的果腐病（ｆｒｕｉｔｒｏｔ）和颈腐病（ｃｏｌｌａｒｒｏｔ），板栗和山毛榉树的根腐病（ｒｏｏｔｒｏｔ），柑桔流胶病（ｇｕｍｍｏｓｉｓｏｆｃｉｔｒｕｓ）等。３．２ 鉴定依据丁香疫霉菌的形态特征、生物学特性、寄主范围等是该检疫鉴定方法的依据（参见附录Ａ）。４ 仪器４．１ 生物显微镜（具油镜镜头）、具透射光源的体视显微镜（最大放大倍数不低于５０×）。４．２ 超净工作台。４．３ 电子天平。４．４ 光照恒温培养箱。４．５ 高压灭菌器。４．６ 培养皿。４．７ 医用手术剪、镊子。４．８ 烧杯（５ｍＬ、１０ｍＬ）。４．９ 试管（直径１２ｍｍ）。４．１０ 载玻片、盖玻片。４．１１ 三角瓶（２５０ｍＬ）。４．１２ 量筒（５００ｍＬ）。４．１３ Ｐａｒａｆｉｌｍ膜或无色透明塑料袋。４．１４ 研钵。１犛犖／犜２７５６—２０１１５ 药品试剂与培养基５．１ 匹马菌素（ｐｉｍａｒｉｃｉｎ，研究用纯粉剂）。５．２ 安苄青霉素（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ，研究用纯粉剂或市售医用注射粉剂）。５．３ 利福平（ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ，研究用纯粉剂或市售医用注射粉剂）。５．４ 五氯硝基苯（ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅ，研究用纯粉剂或市售可湿性粉剂）。５．５ 制霉菌素（ｎｙｓｔａｔｉｎ，研究用纯粉剂或市售医用内服片剂）。５．６ 恶霉灵（ｈｙｍｅｘａｚｏｌ，研究用纯粉剂）。５．７ 席尔氏浮载剂：见ＧＢ／Ｔ１８０８５—２０００中附录Ａ。５．８ 琼脂粉。５．９ 无荧光显微镜物镜镜头油（犖ｄ＝１．５１６）。５．１０ 永久封片剂。５．１１ β谷甾醇。５．１２ 基础培养基：ＰＤＡ培养基、Ｖ８培养基（Ｖ８Ａ）或玉米粉琼脂培养基（ＣＭＡ），配制方法参见附录Ｂ。５．１３ 半选择性培养基：１０００ｍＬ基础培养基经常规灭菌并冷却到５５℃左右时加入下列抗菌素母液，使抗生素有效含量分别为：匹马菌素１０ｍｇ、安苄青霉素２００ｍｇ、利福平１０ｍｇ、五氯硝基苯２５ｍｇ、制霉菌素５０ｍｇ、恶霉灵５０ｍｇ（均为有效成分）。摇匀，倒平板。６ 鉴定方法６．１ 症状检查仔细检查寄主植物的根、茎、叶、果实等部位，对有根腐、颈腐、枝枯、流胶、坏死和果腐症状的植物，以及土壤和介质取样送实验室做进一步检验。６．２ 组织分离将植株置于大烧杯中，在自来水流水下冲洗１ｈ～２ｈ，在根或茎组织病斑边缘病健交接处切取０．５ｃｍ２左右的小块，７０％酒精消毒１ｍｉｎ，灭菌水浸洗１０ｓ～２０ｓ，灭菌滤纸吸干水分，移至半选择性培养基，１７℃～２０℃下培养５ｄ～７ｄ。挑取可疑菌落在半选择性培养基上获得纯培养，然后按照６．３．５～６．３．８的步骤，观察分离到的菌落特征、菌丝特征、藏卵器及雄器特征和卵孢子的特征。６．３ 土壤和介质诱集６．３．１ 土样的准备称量土块或介质，每份２５ｇ，逐份在铁臼中碾碎，除去新鲜的植物组织，盛入５００ｍＬ灭菌洁净烧杯中。６．３．２ 培养将润湿（无流动水）并封口的土样置于１７℃～２０℃下，黑暗条件下放置７ｄ～１０ｄ。６．３．３ 加水和诱集每份样品加灭菌蒸馏水，水面距土表４．０ｃｍ，然后加入１０片左右直径８ｍｍ～１０ｍｍ的新鲜的夏２犛犖／犜２７５６—２０１１栎（犙狌犲狉犮狌狊狉狅犫狌狉）叶片或未成熟的苹果或梨果实的小切片，尽量铺满水面，切片大小以漂浮在水面为宜。然后用Ｐａｒａｆｉｌｍ膜封口保湿，也可用无色透明塑料袋保湿。６．３．４ 培养和检查６ｄ～９ｄ后观察在叶片或苹果或梨附近是否出现明显的棕色病变区，并且检查造成的腐烂是否是硬腐烂，如果符合，则用９６％的酒精表面消毒，从变色的病健交界处取一小块组织，把这块组织放入半选择性培养基中培养。若无上述症状，则将叶片或苹果或梨放在１７℃～２０℃条件下继续培养，直至出现明显的棕色病变区（一般不超过１０ｄ），然后放在半选择性培养基中培养。挑取可疑菌落在半选择性培养基上获得纯培养，然后按照６．３．５～６．３．８的步骤，观察分离到的菌落特征、菌丝特征、藏卵器及雄器特征和卵孢子的特征。６．３．５ 孢子囊的产生和制片镜检在Ｖ８培养基上培养２ｄ～３ｄ的丁香疫霉菌落边缘取０．５ｍｍ（直径），放在土壤浸出液（ＳＥＷ）中室温条件下培养４８ｈ镜检（参见附录Ｂ）。在固体培养基（Ｖ８Ａ，ＰＤＡ）上也能产生很少的孢子囊。进行孢子囊的形态观察和测量时，将上述孢子囊取出制片。注意观察孢子囊的形状、大小、有无乳头状突起和孢子囊梗的生长方式。６．３．６ 萌发游动孢子的单孢分离及培养在体视显微镜下挑取萌发的单个游动孢子至半选择性培养基平板上，置于２０℃、黑暗条件下培养。６．３．７ 菌株纯化上述单个萌发游动孢子分离物在培养过程中如存在污染，应在半选择性培养基上进行两次至三次纯化。获得纯的单个萌发游动孢子分离物后，进行培养特征、有性生殖阶段特征的观察、测量。６．３．８ 卵孢子的诱集在黑暗条件下，在Ｖ８培养基中加入β谷甾醇（２０ｍｇ／Ｌ），低温（８℃～１０℃，４周）条件下；或采用低温和植物油（如：玉米油、亚麻籽油、麦芽油）在培养基的量大于４８ｍＬ／Ｌ时；能够产生大量的卵孢子。７ 鉴定特征７．１ 培养性状丁香疫霉在Ｖ８Ａ和玉米琼脂培养基生长２周后，菌落呈星形。在ＰＤＡ上生长，菌落边缘呈花瓣状，由小的菌丝体浓密地叠积而成，菌落中央区域呈皱孔状。７．２ 形态特征７．２．１ 菌丝和菌丝体（参见附录犆）在Ｖ８Ａ和玉米琼脂培养基上，菌丝３μｍ～６μｍ宽，带有短的分支。常产生球形至卵形的念珠状的菌丝膨大体（小于２５μｍ），偶尔有隔膜，菌丝膨大体通常萌发形成细小的菌丝。７．２．２ 无性生殖阶段特征（参见附录犆）孢子囊梗呈单岐聚伞花序状分枝。孢子囊具有不完全的乳头状突起，典型卵形，罕伸长的倒梨形，孢子囊大小（２１μｍ～７５μｍ）×３犛犖／犜２７５６—２０１１（１１μｍ～４２μｍ），平均４７．０μｍ×３０．０μｍ，长宽比在１．３２∶１至２．１∶１之间，平均１．８∶１。成熟的孢子囊不易脱落，不增殖，但可直接在附近萌发产生一个新的孢子囊。厚垣孢子很少。丁香疫霉的子囊孢子在０℃～２５℃的温度条件下能够萌发，最适温度１５℃～２０℃，超过３０℃不能够萌发。７．３ 有性生殖阶段特征（参见附录犆）丁香疫霉为同宗配合，在培养基和寄主组织上形成大量的藏卵器。雄器多为侧生，偶尔为围生的。藏卵器内充满卵孢子（满器），藏卵器直径２６．４μｍ～３７．８μｍ，平均直径３３μｍ。卵孢子直径２４．４μｍ～３２．８μｍ，平均３０μｍ。７．４ 丁香疫霉菌与其他近似种的主要区别丁香疫霉菌与其他近似种冬生疫霉（犘犺狔狋狅狆犺狋犺狅狉犪犺犻犫犲狉狀犪犾犻狊）的主要区别参见附录Ｄ。８ 结果判定以分离物的培养特征、无性及有性特征等作为鉴定依据，进行综合判定。若以上特征与第７章鉴定特征吻合，鉴定为丁香疫霉病菌。９ 菌株和样品的保存分离并最终鉴定为丁香疫霉菌的菌株应转接到试管斜面上，经登记和经手人签字后置于１２℃～１４℃、黑暗条件下保存，并定期（３０ｄ）转管，防止因斜面干燥而造成病原菌死亡。菌株至少需保存６个月，保存期满后，需经灭菌处理。如发现丁香疫霉，应同时保存样品。４犛犖／犜２７５６—２０１１附 录 犃（资料性附录）丁香疫霉菌相关资料犃．１ 学名学名：犘犺狔狋狅狆犺狋犺狅狉犪狊狔狉犻狀犵犪犲（Ｂｅｒｋ．）Ｋｌｅｂ．１９０９，异名：犘犺狔狋狅狆犺狋犺狅狉犪犮犪犮狋狅狉狌犿ｓｕｂｖａｒ．狊狔狉犻狀犵犪犲（Ｂｅｒｋ．）Ｓａｒｅｊ犖狅狕犲犿犻犪狊狔狉犻狀犵犪犲（Ｂｅｒｋ．）Ｐｅｔｈｙｂｒ犃．２ 地理分布欧洲：比利时、捷克斯洛伐克、丹麦、爱尔兰、英国、法国、希腊、德国、荷兰、意大利、葡萄牙、罗马尼亚、西西里、瑞典、前苏联、前南斯拉夫。北美洲：加拿大、美国。南美洲：阿根廷、巴西。非洲：摩洛哥、南非。亚洲：韩国、印度。大洋洲：澳大利亚、新西兰。犃．３ 寄主范围１４个科中的２９个属，包括木犀科中的欧洲丁香（犛狔狉犻狀犵犪狏狌犾犵犪狉犻狊），欧洲板栗（犆犪狊狋犪狀犲犪狊犪狋犻狏犪），犆犲狉犲狌狊犿犪狉狋犻犪狀狌狊，犆．狋犲狋狉犪犮犪狀狋犺狌狊，柑桔属（犆犻狋狉狌狊ｓｐｐ．），小茴香（犉狅犲狀犻犮狌犾狌犿狏狌犾犵犪狉犲），苹果（犕犪犾狌狊狆狌犿犻犾犪），犘狉狌狀狌狊犪狉犿犲狀犻犪犮犪犔．，酸樱桃（犘．犮犲狉犪狊狌狊），寿星桃（犘．狆犲狉狊犻犮犪），西洋梨（犘狔狉狌狊犮狅犿犿狌狀犻狊）等梨属（犘狔狉狌狊ｓｐｐ．），火棘属（犘狔狉犪犮犪狀狋犺犪ｓｓｐ．）。人工接种可为害欧洲七叶树（犃犲狊犮狌犾狌狊犺犻狆狆狅犮犪狊狋犪狀狌犿），普通赤杨（犃犾狀狌狊犵犾狌狋犻狀狅狊犪），美国流苏树（犆犺犻狅狀犪狀狋犺狌狊狏犻狉犵犻狀犻犮犪），欧洲榛（犆狅狉狔犾狌狊犪狏犲犾犾犪狀犪），英国山楂（犆狉犪狋犪犲犵狌狊狅狓狔犪犮犪狀狋犺犪），迎春花（犑犪狊犿犻狀狌犿狀狌犱犻犳犾狅狉狌犿），欧洲女贞（犔犻犵狌狊狋狉狌犿狏狌犾犵犪狉犲），欧洲李（犘狉狌狀狌狊犱狅犿犲狊狋犻犮犪）和橡木（犙狌犲狉犮狌狊ｓｐｐ．）。犃．４ 传播方式该病原真菌是典型的土壤习居菌，以带菌苗木或带菌土壤进行远距离传播；通常分布在果园的土壤中并且能够存活１５年，在沼泽的土壤中分离生存２年的病原菌对丁香的致病性仍然未减弱。在田间条件下，该病菌通过雨水和灌溉传播。５犛犖／犜２７５６—２０１１附 录 犅（规范性附录）丁香疫霉菌常用的基础培养基配方犅．１ 犞８培养基（犞８犃）１００ｍＬＶ８蔬菜汁，碳酸钙０．２ｇ，琼脂粉１５０ｇ～２０．０ｇ，去离子水９００ｍＬ，１２１℃湿热灭菌２０ｍｉｎ。犅．２ 玉米粉琼脂培养基（犆犕犃）量取５００ｍＬ蒸馏水，加热至７０℃，加入２００ｇ玉米，保持温度在６０℃左右约１ｈ，用纱布过滤后，加入适量的蒸馏水补足５００ｍＬ。另取５００ｍＬ蒸馏水，加入１５．０ｇ～２０．０ｇ琼脂粉，加热使之慢慢融化，过滤后补足水至５００ｍＬ。两液混合后分装，１２１℃灭菌２０ｍｉｎ。将６０ｇ玉米粉加入蒸馏水中，搅匀，文火煮沸１ｈ，纱布过滤，加入１５．０ｇ～２０．０ｇ琼脂粉，加热使之慢慢融化，补