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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２７５４．１０—２０１１出口食品中致病菌环介导恒温扩增（犔犃犕犘）检测方法第１０部分：产气荚膜梭菌犔狅狅狆犿犲犱犻犪狋犲犱犻狊狅狋犺犲狉犿犪犾犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀犱犲狋犲犮狋犻狅狀犿犲狋犺狅犱犳狅狉狆犪狋犺狅犵犲狀狊犻狀犲狓狆狅狉狋犳狅狅犱—犘犪狉狋１０：犆犾狅狊狋狉犻犱犻狌犿狆犲狉犳狉犻狀犵犲狀狊２０１１０２２５发布２０１１０７０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 ＳＮ／Ｔ２７５４《出口食品中致病菌环介导恒温扩增（ＬＡＭＰ）检测方法》共分为１５个部分：———第１部分：金黄色葡萄球菌；———第２部分：大肠杆菌Ｏ１５７；———第３部分：志贺氏菌；———第４部分：单核细胞增生李斯特菌；———第５部分：副溶血性弧菌；———第６部分：小肠结肠炎耶尔森氏菌；———第７部分：空肠弯曲菌；———第８部分：肺炎克雷伯氏菌；———第９部分：溶血性链球菌；———第１０部分：产气荚膜梭菌；———第１１部分：产霍乱毒素的霍乱弧菌；———第１２部分：溶藻弧菌；———第１３部分：创伤弧菌；———第１４部分：假结核耶尔森氏菌；———第１５部分：阪崎肠杆菌。本部分为ＳＮ／Ｔ２７５４的第１０部分。本部分按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国珠海出入境检验检疫局、中华人民共和国盐城出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、广州华峰生物科技有限公司。本部分主要起草人：游淑珠、王小玉、冯家望、邝筱珊、徐帮兴、李志勇、曹以诚、杜正平、成晓维、杨一帆、王志强、陈洵、高东微。Ⅰ犛犖／犜２７５４．１０—２０１１出口食品中致病菌环介导恒温扩增（犔犃犕犘）检测方法第１０部分：产气荚膜梭菌１ 范围ＳＮ／Ｔ２７５４的本部分规定了检测出口食品中产气荚膜梭菌的环介导恒温核酸扩增（ＬＡＭＰ）法。本部分适用于出口食品中产气荚膜梭菌的筛选检测。２ 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ４７８９．１３ 食品微生物学检验 产气荚膜梭菌检验ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法ＧＢ１９４８９ 实验室 生物安全通用要求ＧＢ／Ｔ２７４０３ 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测３ 生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测产气荚膜梭菌，所有培养物和废弃物应按照ＧＢ１９４８９中的有关规定执行。４ 防污染措施防止污染措施应符合ＧＢ／Ｔ２７４０３的规定。５ 缩略语下列缩略语适用于本文件。Ｂｅｔａｉｎｅ：甜菜碱犅狊狋酶［犅狊狋ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ｌａｒｇｅｆｒａｇｍｅｎｔ）］：犅狊狋ＤＮＡ聚合酶（大片段）ＤＮＡ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）：脱氧核糖核酸ｄＮＴＰ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）：脱氧核苷三磷酸ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）：乙二胺四乙酸ＬＡＭＰ（ｌｏｏｐｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）：环介导恒温扩增ＴｒｉｔｏｎＸ１００：聚乙二醇辛基苯基醚６ 技术概要根据产气荚膜梭菌特有的靶序列１６ＳｒＲＮＡ基因（参见附录Ａ）设计的两对特殊的内、外引物，特异１犛犖／犜２７５４．１０—２０１１性识别靶序列上的六个独立区域，利用犅狊狋酶启动循环链置换反应，在１６ＳｒＲＮＡ基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎环ＤＮＡ混合物；从ｄＮＴＰ析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Ｍｇ２＋结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。７ 试剂和材料除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合ＧＢ／Ｔ６６８２中一级水的要求。７．１ 引物：根据产气荚膜梭菌特有的靶序列１６ＳｒＲＮＡ基因设计一套特异性引物，包括外引物１，外引物２和内引物１，内引物２。外引物扩增片段长度：２０７ｂｐ。外引物１（Ｆ３，５’３’）：ＡＡＣＣＴＴＣＡＴＣＡＣＴＣＡＣＧＣＧ外引物２（Ｂ３，５’３’）：ＧＣＡＡＴＣＣＧＣＴＡＴＧＡＧＡＴＧＧＡ内引物１（ＦＩＰ，５’３’）：ＴＧＡＴＣＧＧＣＣＡＣＡＴＴＧＧＧＡＣＴＧＡＴＴＴＴＧＧＴＴＴＣＣＣＣＣＡＴＴＧＴＧＣＡ内引物２（ＢＩＰ，５’３’）：ＣＡＧＧＴＣＧＧＣＴＡＣＧＣＡＴＣＧＴＣＴＴＴＴＣＧＧＣＧＣＡＴＴＡＧＣＴＡＧＴＴＧＧ７．２ ＤＮＡ提取试剂。７．２．１ ＴＥ缓冲液：１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＣｌｐＨ８．０；１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ。７．２．２ ５０ｍｇ／ｍＬ溶菌酶溶液。７．２．３ ２０ｍｇ／ｍＬ蛋白酶Ｋ溶液。７．２．４ １０％ＳＤＳ。７．２．５ ５ｍｏｌ／Ｌ氯化钠。７．２．６ ＣＴＡＢ／ＮａＣｌ溶液：０．７ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ；１０％ＣＴＡＢ。７．２．７ 三氯甲烷／异戊醇（２４∶１）。７．２．８ Ｔｒｉｓ饱和酚。７．２．９ ３ｍｏｌ／Ｌ乙酸钠（ｐＨ６．０）。７．２．１０ 无水乙醇。７．２．１１ ７０％乙醇。７．２．１２ ＲＮａｓｅＡ。７．３ １０×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ缓冲液含：０．２ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ，０．１ｍｏｌ／Ｌ氯化钾，０．１ｍｏｌ／Ｌ硫酸铵，２０ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸镁，１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００。７．４ ｄＮＴＰｓ：每种核苷酸浓度１０ｍｍｏｌ／Ｌ。７．５ 甜菜碱：浓度５ｍｏｌ／Ｌ。７．６ 硫酸镁（ＭｇＳＯ４）：浓度１５０ｍｍｏｌ／Ｌ。７．７ 犅狊狋ＤＮＡ聚合酶：酶浓度８Ｕ／μＬ。７．８ 显色液：ＳＹＢＲＧｒｅｅｎⅠ荧光染料，１０００×。７．９ 阳性对照：产气荚膜梭菌标准菌株，或含目的片段的ＤＮＡ亦可。７．１０ 产气荚膜梭菌ＬＡＭＰ检测试剂盒１），可选，参照试剂盒说明书操作。试剂盒组成及使用注意事项参见附录Ｂ。７．１１ １．５ｍＬ塑料离心管。１） 由广州华峰生物科技有限公司提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。２犛犖／犜２７５４．１０—２０１１８ 仪器和设备８．１ 移液器：量程０．５μＬ～１０μＬ；量程１０μＬ～１００μＬ；量程１００μＬ～１０００μＬ。８．２ 高速台式离心机：≥７０００犵８．３ 水浴锅或加热模块：６５℃±１℃和１００℃±１℃。８．４ 计时器。９ 检测程序食品中产气荚膜梭菌ＬＡＭＰ检测程序见图１。图１ 食品中产气荚膜梭菌犔犃犕犘检测程序１０ 操作步骤２）１０．１ 样品制备、增菌培养按照ＧＢ／Ｔ４７８９．１３的方法制备样品匀液，获得可疑黑色菌落。１０．２ 细菌模板犇犖犃的制备３）１０．２．１ 样品匀液模板犇犖犃的制备 对于１０．１获得的样品匀液，采用如下方法制备模板ＤＮＡ：ａ） 取样品匀液１．５ｍＬ于２ｍＬ离心管，７０００犵离心２ｍｉｎ，去上清液；ｂ） 加入１ｍＬＴＥ洗涤菌体一次，７０００犵离心２ｍｉｎ，去上清液；ｃ） 加入５００μＬＴＥ（ｐＨ８．０）充分振荡，重悬菌体；２） 采用以下方法，也可使用产气荚膜梭菌ＬＡＭＰ检测试剂盒按照说明书操作。３） 采用下述方法，也可使用等效的商品化的ＤＮＡ提取试剂盒并按其说明提取制备模板ＤＮＡ。ｄ） 往管中加入１０μＬ～１５μＬ溶菌酶溶液（５０ｍｇ／ｍＬ，２００００Ｕ／ｍｇ）至终浓度１ｍｇ／ｍＬ，混匀，３犛犖／犜２７５４．１０—２０１１３７℃反应２ｈ～３ｈ，并每１０ｍｉｎ振荡一次；ｅ） 加入１０μＬ蛋白酶Ｋ（２０ｍｇ／ｍＬ），混匀，３７℃反应１ｈ；ｆ） 加入５２μＬ１０％ＳＤＳ至终浓度１％，混匀，３７℃温浴３０ｍｉｎ；ｇ） 加入１００μＬ５ｍｏｌ／Ｌ氯化钠，８０μＬＣＴＡＢ／ＮａＣｌ，混匀，６５℃温浴１０ｍｉｎ；ｈ） 加入等体积三氯甲烷／异戊醇（２４∶１），充分混匀，７０００犵离心５ｍｉｎ；ｉ） 小心移取上清液至２ｍＬ离心管中，加入等体积酚／三氯甲烷／异戊醇（２５∶２４∶１），充分混匀，７０００犵离心５ｍｉｎ；ｊ） 小心移取上清液至２ｍＬ离心管中，加入１／１０体积的３ｍｏｌ／Ｌ乙酸钠（ｐＨ６．０）以及２倍体积的冰冻无水乙醇，混匀，观察是否有絮状沉淀，－２０℃放置３０ｍｉｎ或者更长时间；ｋ） ７０００犵４℃离心，１０ｍｉｎ，去上清液；ｌ） 加入冰冻７０％乙醇洗涤沉淀，７０００犵４℃离心，１０ｍｉｎ，去上清液；ｍ） 沉淀置通风橱风干（约３０ｍｉｎ），加入２００μＬＴＥ（ｐＨ８．０）溶解沉淀；ｎ） 加入２０μｇＲＮａｓｅＡ，３７℃反应３０ｍｉｎ；ｏ） 加入４００μＬＴＥ（ｐＨ８．０）和等体积酚／三氯甲烷／异戊醇（２５∶２４∶１），充分混匀，７０００犵离心５ｍｉｎ；ｐ） 小心移取上清液至２ｍＬ离心管中，加入１／１０体积的３ｍｏｌ／Ｌ乙酸钠（ｐＨ６．０）和２倍体积的冰冻无水乙醇，混匀，－２０℃放置３０ｍｉｎ或者更长时间；ｑ） ７０００犵４℃离心，１０ｍｉｎ，去上清液；ｒ） 加入冰冻７０％乙醇洗涤沉淀，７０００犵４℃离心１０ｍｉｎ，弃去上清液；ｓ） 沉淀置通风橱风干后，加入适量ＴＥ（ｐＨ８．０）或者无菌水溶解，可立即使用或置－２０℃存放６个月备用。１０．２．２ 可疑菌落模板犇犖犃的制备对于１０．１分离到的可疑菌落，可直接挑取可疑菌落，再按照１０．２．１ｂ）步骤制备模板ＤＮＡ以待检测。１０．３ 环介导恒温核酸扩增１０．３．１ 反应体系产气荚膜梭菌ＬＡＭＰ反应体系见表１。表１ 产气荚膜梭菌犔犃犕犘反应体系组分工作液浓度加样量μＬ反应体系终浓度ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ缓冲液１０×２．５１×Ｆ３１０μｍｏｌ／Ｌ０．５０．２μｍｏｌ／ＬＢ３１０μｍｏｌ／Ｌ０．５０．２μｍｏｌ／ＬＦＩＰ４０μｍｏｌ／Ｌ１．０１．６μｍｏｌ／ＬＢＩＰ４０μｍｏｌ／Ｌ１．０１．６μｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ１０ｍｍｏｌ／Ｌ４１．６ｍｍｏｌ／Ｌ甜菜碱５ｍｏｌ／Ｌ４０．８ｍｏｌ／Ｌ４犛犖／犜２７５４．１０—２０１１表１（续）组分工作液浓度加样量μＬ反应体系终浓度硫酸镁１５０ｍｍｏｌ／Ｌ１８ｍｍｏｌ／Ｌ犅狊狋ＤＮＡ聚合酶８Ｕ／μＬ０．５０．１６Ｕ／μＬＤＮＡ模板—２．５—去离子水—７．５—１０．３．２ 反应过程１０．３．２．１ 按表１所述配制反应体系。１０．３．２．２ ６５℃扩增６０ｍｉｎ。１０．３．３ 空白对照、阴性对照、阳性对照设置每次反应应设置阴性对照、空白对照和阳性对照。空白对照以水替代ＤＮＡ模板。阴性对照以提取空白代替模板ＤＮＡ。也可使用产气荚膜梭菌ＬＡＭＰ检测试剂盒中的阴性对照。阳性对照制备：将产气荚膜梭菌标准菌株接种于液体硫乙醇酸盐培养基营养肉汤中３６℃±１℃培养１８ｈ～２４ｈ，用无菌生理盐水稀释至约１０６ＣＦＵ／ｍＬ～１０８ＣＦＵ／ｍＬ（约麦氏浊度０．４），按１０．２提取模板ＤＮＡ作为ＬＡＭＰ反应的模板。也可使用产气荚膜梭菌ＬＡＭＰ检测试剂盒中的阳性对照。１０．４ 结果观察在上述反应管中加入２μＬ显色液，轻轻混匀并在黑色背景下观察。建议使用ＬＡＭＰ试剂盒专用反应管，将反应液和显色液一次性加入，ＤＮＡ扩增反应后可不必开盖即可观察结果。１０．５ 结果判定和报告在空白对照和阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下：ａ） 待检样品反应管液体呈绿色，该样品结果为产气荚膜梭菌初筛阳性，对样品匀液或可疑纯菌落进一步按ＧＢ／Ｔ４７８９．１３中操作步骤进行确认后报告结果；ｂ） 待检样品反应管液体呈橙色则可报告产气荚膜梭菌检验结果为阴性。若与上述条件不符，则本次检测结果无效，应更换试剂按本方法重新检测。５犛犖／犜２７５４．１０—２０１１附 录 犃（资料性附录）产气荚膜梭菌１６犛狉犚犖犃基因序列犃．１ 产气荚膜梭菌１６犛狉犚犖犃基因序列（犪犮犮犲狊狊犻狅狀狀狅．犌犙９１１５５８．１）１ ａｇｔｔｔｇａｔｃｃｔｇｇｃｔｃａｇｇａｔｇａａｃｇｃｔｇ