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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准!!#!##!$%$小反刍兽疫检疫技术规范$%&’&()*(+,’-)-.&/0-’,+1)+2+1,+)*)1’%3*(&()1!$%$4%%4$%发布!$%%4$&4$%实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国云南出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国西藏出入境检验检疫局。本标准主要起草人：董俊、杨建民、严树发、杨云庆、艾军、叶玲玲、徐自忠、花群义、周晓黎。Ⅰ犛犖／犜２７３３—２０１０小反刍兽疫检疫技术规范１ 范围本标准规定了小反刍兽疫的病原分离及鉴定、聚合酶链式反应、血清抗体中和试验、酶联免疫吸附试验检测方法。本标准适用于小反刍兽疫的诊断和流行病学调查。２ 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ１８０８８ 出入境动物检疫采样３ 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１小反刍兽疫 狆犲狊狋犲犱犲狊狆犲狋犻狋狊狉狌犿犻狀犪狀狋狊；犘犘犚由小反刍兽疫病毒引起的一种急性病毒性传染病，主要感染小反刍动物，以发热、口炎、腹泻、肺炎为特征。４ 疾病简介参见附录Ａ。５ 现场检验检疫及采样５．１ 现场检验检疫：逐头进行临床检查，根据临床表现和特异性病理变化做出初步诊断。５．２ 采样：按ＧＢ／Ｔ１８０８８规定，逐头进行采样，并按规定填写《送样单》送实验室。６ 诊断方法６．１ 病毒分离、鉴定（生物安全三级实验室进行）６．１．１ 试剂和材料６．１．１．１ 小反刍兽疫标准阳性、阴性血清。６．１．１．２ 细胞：羊肾原代细胞或非洲绿猴肾细胞（ＶＥＲＯ）。６．１．１．３ 培养液：１９９或ＭＥＭ培养基中加１０％犊牛血清（经５６℃３０ｍｉｎ灭能），含青霉素２００ＩＵ／ｍＬ、链霉素２００ＩＵ／ｍＬ。１犛犖／犜２７３３—２０１０６．１．１．４ 维持液：１９９或ＭＥＭ培养基中加２％的犊牛血清（经５６℃３０ｍｉｎ灭能），含青霉素２００ＩＵ／ｍＬ、链霉素２００ＩＵ／ｍＬ。６．１．１．５ 细胞分散液：配制见附录Ｂ。６．１．１．６ 犊牛血清：不含细菌、支原体，５６℃灭能３０ｍｉｎ。６．１．１．７ ＰＢＳ缓冲液：配制见附录Ｂ。６．１．２ 设备６．１．２．１ 超净工作台。６．１．２．２ 乳钵或组织捣碎器。６．１．２．３ 倒置显微镜。６．１．２．４ 二氧化碳培养箱。６．１．２．５ 可调单头微量移液器（０．５μＬ～１０μＬ，１０μＬ～１００μＬ，１００μＬ～１０００μＬ）。６．１．２．６ 冷冻微量离心机。６．１．２．７ ２４孔、９６孔细胞培养板。６．１．２．８ 微型振荡器。６．１．３ 样品采集６．１．３．１ 活体动物采集眼睑下结膜分泌物和鼻腔分泌物、颊部及直肠粘膜病料拭子。采集全血时加肝素抗凝剂。死亡动物，解剖尸体２头～３头，取淋巴结，特别是肠系膜和支气管淋巴结，脾和肠粘膜也应采集。采集后立即密封、冷藏送检或置含抗生素的ＰＢＳ缓冲液中－２０℃密封保存。编号和作好记录。６．１．３．２ 眼睑下结膜分泌物和鼻腔、颊部及直肠粘膜病料拭子：用拭子采取分泌物，拭子一并放入盛有１．０ｍＬ含抗生素的ＰＢＳ缓冲液的１．５ｍＬ离心管中。编号，冷藏送检或低温密封保存。６．１．３．３ 血液：无菌、肝素抗凝采集，密封、编号后保存于４℃送检。６．１．３．４ 组织脏器：无菌采集待检样品，装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号，密封、冷藏送检或低温密封保存。６．１．３．５ 精液：抽检的精液样品应不少于１ｍＬ，冻精样品每头每批次取样３管～５管，编号，置冰盒送检。６．１．４ 样品贮运样品采集后，按批次放入密闭的采样袋内，低温、密封，送实验室。６．１．５ 样品处理６．１．５．１ 眼睑下结膜分泌物和鼻腔分泌物、颊部及直肠粘膜病料拭子收到棉拭子样品后，５００μＬＰＢＳ溶解，样品振荡混合后，用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出，经４℃１００００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液作为组织培养的接种材料，编号备用。６．１．５．２ 组织脏器取待检样品２．０ｇ于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加１０ｍＬ细胞维持液混匀，４℃５０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，取上清液转入无菌的１．５ｍＬ离心管中，编号备用。６．１．５．３ 精液用维持液将精液作１∶５稀释，４℃５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液作为接种分离病毒的材料。２犛犖／犜２７３３—２０１０６．１．５．４ 血液样品４℃５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，用移液器吸出血浆（不要破坏白细胞层），补充ＰＢＳ至原体积，轻轻倒转试管几次：４℃５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃上清液（保留白细胞层）。加入等量无菌的去离子水，轻轻倒转试管几次，使血细胞溶解；或用４０μＡ的超声波１ｍｉｎ打碎红血球，４℃５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液转入无菌的１．５ｍＬ离心管中，编号备用。６．１．６ 病毒培养６．１．６．１ 按常规方法制备羊肾原代细胞或ＶＥＲＯ细胞单层。６．１．６．２ 样品接种：取经处理过的样品接种到已形成良好单层的羊肾原代细胞或ＶＥＲＯ细胞的２４孔培养板中。每份样品接种４孔，每孔０．５ｍＬ。于３７℃吸附１ｈ，倾去接种液，用维持液洗１次～２次，最后加入维持液１ｍＬ。置３７℃５％二氧化碳培养箱培养，逐日观察细胞病变；若５ｄ仍不致细胞病变，则反复冻融３次，收取培养物继代于新制备的细胞上盲传３代，出现细胞病变者，收取培养物，保存于－７０℃以下待鉴定。６．１．７ 结果判定６．１．７．１ 如盲传３代后无细胞病变，判为阴性。６．１．７．２ 本病毒在羔羊肾细胞的细胞病变包括细胞变圆，细胞集合，呈葡萄串状、拉网、最后形成合胞体。在ＶＥＲＯ上有时很难看到合胞体。６．１．７．３ 取出现上述病变的细胞培养物，经冻融裂解两次后，以１００００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液作病毒中和试验。６．１．８ 病毒中和试验６．１．８．１ 毒价测定：方法同小反刍兽疫血清中和试验。６．１．８．２ 分离物作病毒中和试验：用小反刍兽疫标准阳性血清和标准阴性血清（由ＯＩＥ推荐的小反刍兽疫参考实验室提供）分别与该分离物作病毒中和试验（固定血清，稀释病毒法）。６．１．８．３ 结果判定：能与小反刍兽疫标准阳性血清中和，使５０％以上细胞不出现细胞病变（ＣＰＥ）判为阳性。６．２ 聚合酶链式试验（犚犜犘犆犚）６．２．１ 试剂和材料６．２．１．１ ＲＮＡ提取液（Ｔｒｉｚｏｌ）。６．２．１．２ 无水乙醇（分析纯）。６．２．１．３ ＡＭＶ反转录酶（１３Ｕ／μＬ）。６．２．１．４ ｄＮＴＰｓ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）。６．２．１．５ ＲＮＡｓｉｎ（４０Ｕ／μＬ）。６．２．１．６ 犜犪狇ＤＮＡ聚合酶（５Ｕ／μＬ）。６．２．１．７ 氯化镁（２５ｍｍｏｌ／ｍＬ）。６．２．１．８ 引物（２５ｐｍｏｌ／μＬ）：根据ＰＰＲ毒株编码核蛋白的Ｎ基因保守序列设计，扩增产物为３５１ｂｐ，上游引物Ｆ：５’ＴＣＴＣＧＧＡＡＡＴＣＧＣＣＴＣＡＣＡＧＡＣＴＧ３’；下游引物Ｒ：５ＣＣＴＣＣＴＣＣＴＧＧＴＣＣＴＣＣＡＧＡＡＴＣＴ３’。６．２．１．９ 焦碳酸二乙酯（ＤＥＰＣ）。３犛犖／犜２７３３—２０１０６．２．１．１０ 电泳缓冲液（ＴＢＥ）、溴化乙锭（１０ｍｇ／ｍＬ）、ＤＥＰＣ水的配制见附录Ｂ。６．２．１．１１ 琼脂糖（电泳级）。６．２．１．１２ ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００分子量标准。６．２．２ 主要器械和设备６．２．２．１ 离心机：低温高速离心机、微量高速离心机。６．２．２．２ 旋涡振荡器。６．２．２．３ 扩增仪。６．２．２．４ 凝胶电泳仪、水平电泳槽。６．２．２．５ 凝胶紫外检测仪。６．２．２．６ 超声波捣碎仪。６．２．３ 样品处理６．２．３．１ 血液样品处理无菌采集含１％ＥＤＴＡ的抗凝血１０ｍＬ；５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，用移液器吸出血浆（不要破坏白细胞层），补充ＰＢＳ至原体积，轻轻倒转试管几次；５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃上清液（保留白细胞层）；加入等量无菌、经ＤＥＰＣ处理（无ＲＮＡ酶）的去离子水，轻轻倒转试管几次，使血细胞溶解；或用４０μＡ的超声波１ｍｉｎ打碎红血球。６．２．３．２ 血凝块处理无菌采集血液１０ｍＬ，凝固后取血凝块；冻融２次～３次；５０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，取上清液备用。６．２．３．３ 阳性对照样品的制备将小反刍兽疫病毒按１０％接种羊肾原代细胞或ＶＥＲＯ细胞，于３７℃吸附１ｈ，加入维持液，３７℃５％二氧化碳培养箱中培养，待细胞病变（ＣＰＥ）达７５％时收获病毒悬液；冻融２次～３次，５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液备用。６．２．３．４ 阴性对照样品的制备将生长良好的羊肾原代细胞或ＶＥＲＯ细胞，冻融１次～２次，５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液备用。６．２．４ 犚犖犃的提取６．２．４．１ 在样品处理区进行（除本标准规定的方法外，也可采用其他等效的ＲＮＡ提取方法，具体操作见有关试剂说明书）。所有ＲＮＡ提取器皿用ＤＥＰＣ水浸泡２４ｈ，灭菌后方可使用。６．２．４．２ 取狀个１．５ｍＬ灭菌离心管，其中狀为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，对每管进行编号标记。６．２．４．３ 每管加入７５０μＬＴｒｉｚｏｌ，然后分别加入待检样品、阳性对照和阴性对照各２５０μＬ，混匀，静置５ｍｉｎ；再加入２００μＬ三氯甲烷，混匀，静置５ｍｉｎ，于４℃条件下，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ。６．２．４．４ 取相同数量的１．５ｍＬ灭菌离心管，加入５００μＬ异丙醇（－２０℃预冷），对各个管进行对应编号。吸取离心后各管中的上清液转移至相应的新管中，上清液吸取约５００μＬ（注意不要吸出中间白色絮状层），颠倒均匀。６．２．４．５ 于４℃条件下，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ。取出离心管，轻轻倒去上清液，加入１ｍＬ７５％乙４犛犖／犜２７３３—２０１０醇，颠倒洗涤。６．２．４．６ 于４℃条件下，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ。取出离心管，轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。６．２．４．７ 每管加入２０μＬ灭菌ＤＥＰＣ水，轻轻混匀，溶解管壁上的ＲＮＡ，２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｓ，冰上保存备用。提取的ＲＮＡ应在２ｈ内进行ＲＴＰＣＲ扩增或放置于－７０℃冰箱备用。６．２．５ 反转录合成犮犇犖犃６．２．５．１ ＲＮＡ变性：取作好标记的离心管依次加入，随机引物（Ｎ６），２μＬ；提取的ＲＮＡ７μＬ；ＤＥＰＣ水，５μＬ。瞬时离心；７０℃１０ｍｉｎ，冰浴２ｍｉｎ。３０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ。６．２．５．２ 反转录：于６．２．５．１离心管中依次加入：５×反转录酶缓冲液，４μＬ；ｄＮＴＰｓ，１μＬ；ＲＮａｓｉｎ，０．５μＬ；ＡＭＶ反转录酶，０．５μＬ。瞬时离心，４２℃／６０ｍｉｎ；７０℃／１５ｍｉｎ；冰浴３ｍｉｎ，瞬时离心，立即进行ＰＣＲ扩增或－２０℃保存备用。６．２．６ 犘犆犚扩增反应６．２．６．１ 在ＰＣＲ管中依次加入以下试剂：１０×ＰＣＲ缓冲液５μＬ，氯化镁３μＬ，ｄＮＴＰｓ１μＬ，犜犪狇ＤＮＡ酶０．５μＬ，引物Ｆ１μＬ，引物Ｒ１μＬ，ｃＤＮＡ４μＬ，ＤＥＰＣ水，３４．５μＬ。６．２．６．２ 反应管瞬时离心，置ＰＣＲ仪内运行下列程序：９５℃／５ｍｉｎ；９４℃／３０ｓ，５５℃／３０ｓ，７２℃／３０ｓ，３０个循环；７２℃／１０ｍｉｎ，４℃保存。６．２．７ 犘犆犚产物的检测６．２．７．１ １．０％琼脂糖凝胶的制备，见附录Ｂ。６．２．７．２ 取扩增产物８μＬ与载样缓冲液混合，分别加入凝胶孔中。恒压５Ｖ／ｃｍ～８Ｖ／ｃｍ，电泳３０ｍｉｎ～６０ｍｉｎ紫外检测仪下观察结果、照相。６．２．７．３ 结果判定：阴性样品无条带，阳性样品有条带，扩增条带为３５１ｂｐ的条件下进行判定，如被检样品无条带则结果为病毒核酸阴性；如被检样品有条带，其扩增产物大小