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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２７１７—２０１０马传染性贫血检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犲狇狌犻狀犲犻狀犳犲犮狋犻狅狌狊犪狀犲犿犻犪２０１０１１０１发布２０１１０５０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：朱来华、梁成珠、郑小龙、邓明俊、肖西志、岳志芹、辛学谦、孙涛、王群。Ⅰ犛犖／犜２７１７—２０１０马传染性贫血检疫技术规范１ 范围本标准规定了马传染性贫血的临床诊断、病毒分离鉴定、酶联免疫吸附试验、琼脂凝胶免疫扩散试验等检疫技术。本标准适用于马属动物马传染性贫血的检疫和诊断。２ 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法ＧＢ／Ｔ１７４９４ 马传染性贫血病间接ＥＬＩＳＡ诊断技术３ 临床诊断３．１ 临床特征马传染性贫血（ＥＩＡ）特征性症状及病理变化表现为高热稽留（３９℃以上）、或间歇热（持续高热３ｄ～５ｄ，经３ｄ～１５ｄ常温间歇期又复发）、或出现温差倒转现象；在舌底、口腔、鼻腔、阴道粘膜及眼结膜等处，常见鲜红色至暗红色出血点（斑）等；贫血、黄疸、心脏衰弱、浮肿和消瘦等特征性症状及病理变化。３．２ 判定根据特征性症状及病理变化（见３．１）可做出初步诊断。进一步确诊应采集病料或血清样品进行实验室检查。４ 实验室检测方法４．１ 病毒分离鉴定４．１．１ 试验材料细胞培养瓶（８０ｍＬ），赛氏液、细胞生长液、阿氏液、驴外周血白细胞制备见附录Ａ。实验室用水按照ＧＢ／Ｔ６６８２规定。４．１．２ 病料采集与处理无菌采集被检马属动物的抗凝血，在室温放置３０ｍｉｎ～４０ｍｉｎ，收集中间淡黄色的白细胞层，每管分装５００μＬ，４０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃上清液，白细胞沉淀－８０℃保存备用。４．１．３ 细胞培养按附录Ａ制备驴外周血白细胞，加入细胞生长液后培养１ｄ～２ｄ后，如细胞已贴壁并伸出突起，即可接种病料。１犛犖／犜２７１７—２０１０４．１．４ 病料接种在倾弃细胞培养液后，接种病料５００μＬ，３７℃吸附１ｈ～２ｈ后吸弃接种的病料，换入新鲜的细胞生长液。４．１．５ 培养接种病料的细胞在３７℃含５％二氧化碳培养箱培养７ｄ～８ｄ，每天在倒置显微镜下观察。初代分离培养通常难以出现细胞病变，一般需盲传２代～３代。４．１．６ 判定标准如盲传２代～３代，仍无细胞病变，则判定为阴性。如出现以细胞变圆、破碎、脱落为特征的细胞病变，则初步判定为阳性。病毒鉴定需要以１∶１００浓缩的阳性培养物为抗原进行酶联免疫吸附试验（见４．２）或琼脂凝胶免疫扩散试验（见４．３）进行确诊。４．２ 酶联免疫吸附试验（犈犔犐犛犃）４．２．１ 血清抗体检测按常规方法静脉采集马属动物血液并分离血清，２℃～８℃冷藏保存备用。ＥＬＩＳＡ按照ＧＢ／Ｔ１７４９４操作。４．２．２ 病毒分离物鉴定按４．１制备病毒培养物，以原体积１∶１００浓缩阳性培养物，并以浓缩阳性培养物为包被抗原，ＥＬＩＳＡ按照ＧＢ／Ｔ１７４９４操作。４．３ 琼脂凝胶免疫扩散试验（犃犌犐犇）４．３．１ 器材微量移液器、平皿、三角瓶、薄壁型金属打孔器（外周直径５ｍｍ）。４．３．２ 试剂ＰＢＳ按附录Ｂ．１配制。实验室用水按照ＧＢ／Ｔ６６８２规定。标准抗原和标准阳性血清、阴性血清。使用前，按说明书规定稀释至工作浓度。４．３．３ 样品制备４．３．３．１ 血清：按４．２．１制备血清。４．３．３．２ 病原制备：按４．２．２制备病原。４．３．４ 琼脂板的制备取优质琼脂１．０ｇ，可直接放入含有万分之一硫柳汞的１００ｍＬ的ＰＢＳ液中，用热水浴融化混匀，倒入直径９０ｍｍ的平皿１５ｍＬ～１８ｍＬ，厚度约２．５ｍｍ左右，冷却备用。４．３．５ 打孔反应孔现用现打并封底。在坐标纸上画好七孔型图案。把坐标纸放在带有琼脂板的平皿或玻璃板下面，照图案在固定位置上用金属管打孔，将切下的琼脂板取出，勿使琼脂膜与玻璃面离动。外周孔径２犛犖／犜２７１７—２０１０为５ｍｍ，中央孔径为５ｍｍ，孔间距３ｍｍ，如图１所示。打孔完毕，在琼脂板上端写上日期及编号等。图１ 七孔型４．３．６ 滴加样品４．３．６．１ 血清抗体检测在图１（七孔型）的中央孔加抗原，２、５孔加检验用标准阳性血清，其余１、３、４、６孔加入受检血清。４．３．６．２ 病毒分离物鉴定在图１（七孔型）的中央孔加阳性，２、５孔加检验用标准阳性抗原，其余１、３、４、６孔加入受检病毒分离物。４．３．７ 温育平皿加盖，待孔中液体吸干后，将平皿倒置，以防水分蒸发；琼脂板则放入铺有数层湿纱布的带盖搪瓷盘中。置１５℃～３０℃条件下进行反应，逐日观察３ｄ并记录结果。４．３．８ 结果判定４．３．８．１ 血清抗体检测判定４．３．８．１．１ 阳性：当标准阳性血清孔与标准阳性抗原孔之间只有一条明显致密的沉淀线时，受检血清孔与标准阳性抗原孔之间形成一条沉淀线；或者阳性血清的沉淀线末端向毗邻的受检血清的抗原侧偏弯者，则判定为阳性。４．３．８．１．２ 阴性：受检血清与标准阳性抗原孔之间不形成沉淀线，或者标准阳性血清孔与标准阳性抗原孔之间的沉淀线向毗邻的受检血清孔直伸或向受检血清孔侧偏弯者，则判定为阴性。４．３．８．１．３ 疑似：标准阳性血清孔与标准阳性抗原孔间的沉淀线末端，似乎向毗邻受检血清孔内侧偏弯，但不易判断时，可将标准阳性抗原稀释２倍、４倍、６倍、８倍进行复试，最后判定结果。观察时间可延至５ｄ。４．３．８．２ 病毒分离物判定４．３．８．２．１ 阳性：当标准阳性血清孔与标准阳性抗原孔之间只有一条明显致密的沉淀线时，病毒分离物孔与标准阳性血清孔之间形成一条沉淀线；或者标准阳性抗原的沉淀线末端向毗邻的病毒分离物的抗原侧偏弯者，则判定为阳性。４．３．８．２．２ 阴性：病毒分离物孔与标准阳性血清孔之间不形成沉淀线，或者标准阳性抗原与标准阳性血清孔之间的沉淀线向毗邻的病毒分离物直伸或向病毒分离物侧偏弯者，则判定为阴性。４．３．８．２．３ 疑似：标准阳性血清孔与标准阳性抗原孔间的沉淀线末端，似乎向毗邻病毒分离物孔内侧偏弯，但不易判断时，可将标准阳性血清稀释２倍、４倍、６倍、８倍进行复试，最后判定结果。观察时间可延至５ｄ。３犛犖／犜２７１７—２０１０５ 综合判定５．１ 根据３．２临床诊断的结果仅可做出初步，但确诊有待于实验室诊断。５．２ 根据病原分离与鉴定的结果（见４．１．６）可做出病原学确诊。５．３ 根据ＥＬＩＳＡ结果判定（见４．２．１）可初步判定为血清学阳性，根据琼脂凝胶免疫扩散试验结果（见４．３．８．１）可最终判定为血清学阳性。４犛犖／犜２７１７—２０１０附 录 犃（规范性附录）驴外周血白细胞制备犃．１ 试剂准备犃．１．１ 赛氏液氯化钠（ＮａＣｌ） ７．６５ｇ氯化钾（ＫＣｌ）０．２ｇ乙酸钠（ＣＨ３ＣＯＯＮａ·３Ｈ２Ｏ）１．５ｇ磷酸二氢钠（ＮａＨ２ＰＯ４·Ｈ２Ｏ）０．０５ｇ磷酸氢二钾（Ｋ２ＨＰＯ４）０．１ｇ碳酸氢钠（ＮａＨＣＯ３）０．７ｇ葡萄糖１ｇ抗坏血酸０．００３ｇ无离子水或蒸馏水加至１０００ｍＬ，４℃保存备用犃．１．２ 细胞生长液牛血清和赛氏液等量混合培养液（含青霉素１００ＩＵ／ｍＬ、链霉素１００μｇ／ｍＬ、庆大霉素５０μｇ／ｍＬ）。犃．１．３ 阿氏液（犃犾狊犲狏犲狉’狊狊狅犾狌狋犻狅狀）葡萄糖２．０５ｇ柠檬酸钠０．８ｇ柠檬酸０．０５５ｇ氯化钠（ＮａＣｌ）０．４２ｇ加蒸馏水至１００ｍＬ，混匀溶解后，１１５℃高压蒸汽灭菌１０ｍｉｎ备用。犃．２ 驴外周血白细胞制备从驴颈静脉处无菌采取血液１０ｍＬ，置于预先加入抗凝剂（阿氏液１０ｍＬ）的三角瓶中；室温或３７℃培养箱中静置２０ｍｉｎ～３０ｍｉｎ，至红细胞沉降；吸取上层血浆（含驴白细胞），１０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ收集细胞；弃上清液，加入赛氏液吹散细胞，１０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ收集细胞；重复上一步骤，弃上清液加入赛氏液吹散细胞，１０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ收集细胞；加入适量牛血清和赛氏液等量混合培养液均匀悬浮细胞，分至培养瓶，３７℃于５％二氧化碳培养箱培养；２４ｈ后，换用含７０％牛血清、３０％赛氏液的培养液，３７℃于５％二氧化碳培养箱继续培养。５犛犖／犜２７１７—２０１０附 录 犅（规范性附录）溶液配制犅．１ 犘犅犛液（０．０１犿狅犾／犔犘犅犛，狆犎７．４）磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ）２．９ｇ磷酸二氢钾（ＫＨ２ＰＯ４）０．３ｇ氯化钠（ＮａＣｌ）８．０ｇ无离子水或蒸馏水加至１０００ｍＬ，４℃保存备用。６犛犖／犜２７１７—２０１０