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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准!!#!##!#$#母羊地方流行性流产补体结合试验操作规程$%&’&(&)&*(&+,)-+-.’*/01’/&.’-2’*&%-.3&&’/(14&%’/&.&*-5-2!67/.-(8)1+9:/&2/2!#$#;$$;#$发布!#$$;#%;#$实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前!!言!!本标准按照!!#$%$&’’(给出的规则起草#本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口#本标准起草单位$中华人民共和国湖北出入境检验检疫局%湖北省农业科学院畜牧兽医研究所#本标准主要起草人$张汉协%刘泽文%陈平%徐涤平%段正赢%汪宏才%杨宜生#!!!#!##!#$#母羊地方流行性流产补体结合试验操作规程$!范围本标准规定了母羊地方性流产&羊衣原体病’补体结合试验操作规程#本标准适用于母羊地方流行性流产的血清学诊断和流行病学调查#!!规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的#凡是注日期的引用文件(仅注日期的版本适用于本文件#凡是不注日期的引用文件(其最新版本&包括所有的修改单’适用于本文件#!$()*(!实验室!生物安全通用要求%!缩略语下列缩略语适用于本文件#+,&-./012/234567846.34294’$补体结合试验&!设备%材料和试剂&%$!器材$$&:;//试管%试管架%水浴箱%=型微量滴定板&*孔:$&孔’#&%!!补体$由指定单位供应(按说明书使用和保存#&%%!溶血素$由指定单位供应#&%&!敏化红细胞$制备及使用方法见附录中表注#&%’!$?绵羊红细胞悬液$制备方法见附录#&%(!抗原和标准阳性血清%阴性血清$由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所供应(按说明书使用#’!采样%送检和处理按常规方法采血(分离血清(要求不溶血%无腐败(在血清中加入’%’$?硫柳汞或’%$?叠氮钠防腐(&@*@保存(试验前需A*@A(@灭活;’/63#(!操作步骤(%$!预备试验(%$%$!补体效价滴定$试验前应对补体进行效价滴定#滴定方法见附录#(%$%!!溶血素效价滴定$试验前应对溶血素进行效价滴定(以后每隔&个月测定效价一次#滴定方法见附录+#$!!#!##!#$#(%$%%!抗原%阳性血清效价滴定$抗原和阳性血清效价滴定的方法见附录B#(%!!正式试验&包括试管法和微量法’(%!%$!试管法$按表$的程序操作#试验要同时设抗补体对照%阳性血清对照%阴性血清对照%抗原对照%溶血素对照和生理盐水对照#表$!补体结合试验&试管法’单位为毫升成分被!检!血!清各!项!对!照试!验!管抗补体对照阳性血清阴性血清抗原对照溶血素生理盐水效价$C)$C*$C$D$C;&$CD)$C$&*$C)&个工作量$C)&个工作量血清’%$’%$’%$’%$’%$’%$’%$’%$’%$&工作量抗原’%$’%$’%$’%$’%$’%$’%$’%$’%$&单位补体’%&’%&’%&’%&’%&’%&’%&’%&’%&’%&’%&生理盐水’%$’%$’%&’%)混匀()@$DE$*E感作(取出后;@水浴;’/63敏化红细胞’%&’%&’%&’%&’%&’%&’%&’%&’%&’%&’%&’%&混匀(;@水浴;’/63结果判定##FFFFFFGG#GGG#全不溶全不溶&A?溶A’?溶A?溶全溶全溶全不溶全溶全溶全溶全不溶$C;&(%!%!!微量法$用=型*:$&孔反应板#按表&的程序操作#试验同时设抗补体对照%阳性血清对照%阴性血清对照%抗原对照%溶血素对照和生理盐水对照#表!!补体结合试验&微量法’单位为微升成分被!检!血!清各!项!对!照试!验!孔抗补体对照阳性血清阴性血清抗原对照溶血素生理盐水效价$C)$C*$C$D$C;&$CD)$C$&*$C)&个工作量$C)&个工作量血清&A&A&A&A&A&A&A&A&A&工作量抗原&A&A&A&A&A&A&A&A&A&单位补体A’A’A’A’A’A’A’A’A’A’A’生理盐水&A&AA’$’’&!!#!##!#$#表!&续’单位为微升成分被!检!血!清各!项!对!照试!验!孔抗补体对照阳性血清阴性血清抗原对照溶血素生理盐水效价$C)$C*$C$D$C;&$CD)$C$&*$C)&个工作量$C)&个工作量混匀()@$DE$*E感作(取出后;@水浴;’/63敏化红细胞A’A’A’A’A’A’A’A’A’A’A’A’混匀(;@水浴;’/63结果判定##FFFFFFGG#GGG#全不溶全不溶&A?溶A’?溶A?溶全溶全溶全不溶全溶全溶全溶全不溶$C;&!结果判定%$!在最后一次;@水浴&或汽浴’;’/63后(立即进行试验结果判定#%!!各组对照为如下结果时试验方成立(否则应重复试验$被检血清抗补体对照$完全溶血&G’)阳性血清加抗原对照$完全抑制溶血&#’)阴性血清加抗原对照$完全溶血&G’)抗原抗补体对照$完全溶血&G’)溶血素对照$完全溶血&G’)生理盐水对照$完全抑制溶血&#’#%%!判定标准$血清效价以A’?溶血&FF’为判定终点#被检血清效价$$C*&FF’判为阳性)$C)&FFF’判为阴性)$C)&FF’判为可疑)重复试验仍为可疑(则判为阳性#;!!#!##!#$#附!录!$&规范性附录’补体效价滴定$%$!用生理盐水将补体作$CD’稀释(按表%$测定补体效价#表$%$!补体效价滴定单位为毫升组别抗原生理盐水试管号$&;)AD$&;)AD二单位抗原’%$’%$’%$’%$’%$’%$’%$GGGGGGG生理盐水’%&’%&A’%&&’%&’’%$*’%$D’%$)’%;’%;A’%;&’%;’’%&*’%&D’%&)$CD’补体’%’;’%’A’%’*’%$’’%$&’%$)’%$D’%’;’%’A’%’*’%$’’%$&’%$)’%$D混匀(;@水浴;’/63敏化红细胞’%&’%&’%&’%&’%&’%&’%&’%&’%&’%&’%&’%&’%&’%&混匀(;@水浴;’/63结果示例#FFFFFFGGG#FFFFFFGGG全不溶&A?溶A’?溶A?溶全溶全溶全溶全不溶&A?溶A’?溶A?溶全溶全溶全溶!!注$敏化红细胞系由$?公绵羊红细胞悬液加等量的&个工作单位的溶血素(放;@水浴$A/63后再滴加#$%!!补体效价的计算$能使红细胞完全溶血的补体量即为$个补体单位(表%$所示第A管’%$&/H为一个补体单位#而正式试验使用两个补体单位(原补体在使用时应稀释的倍数按下列公式计算$原补体应稀释倍数I使用时每管加入量:滴定时补体稀释倍数一个单位量:&I’%&:D’’%$&:&IA’&倍’)!!#!##!#$#附!录!%&规范性附录’$&绵羊红细胞悬液的制备%%$!颈静脉采取成年健康公绵羊血液(以常规方法脱纤后(按$C$加入红细胞保存液(混匀后分装成A/H$’/H一瓶(封固后放)@冰箱可保存&个周(用前用生理盐水洗涤;次(最后一次在;’’’J!/63离心A/63(按红细胞泥容量加生理盐水配成$?红细胞悬液#%%!!红细胞保存液配方$葡萄糖&’%AK(氯化钠)%&K(柠檬酸三钠*K(柠檬酸’%AAK(蒸馏水加至$’’’/H($$A@&’/63灭菌(备用#A!!#!##!#$#附!录!’&规范性附录’溶血素效价滴定’%$!先将溶血素$C$’’稀释&’%&/H含甘油的溶血素加(%*/H生理盐水’(按表+%$稀释成不同倍数(再按表+%&操作#表’%$!溶血素稀释单位为毫升成!分管号及稀释倍数$&;)AD*($’’’&’’’;’’’)’’’A’’’D’’’’’’*’’’(’’’生理盐水($&;)AD*$C$’’溶血素$$C$’’’溶血素$$$$$$$$表’%!!溶血素效价测定单位为毫升成!分管号及稀释倍数$&;)AD*(对照$’’’&’’’;’’’)’’’A’’’D’’’’’’*’’’(’’’补体$C$’’溶血素$?红细胞稀释熔血素’%$’%$’%$’%$’%$’%$’%$’%$’%$’’%$’生理盐水’%&’%&’%&’%&’%&’%&’%&’%&’%&’%;’%&’%A$CD’补体’%&’%&’%&’%&’%&’%&’%&’%&’%&’%&’%&’$?红细胞’%$’%$’%$’%$’%$’%$’%$’%$’%$’%$’%$’%$充分摇匀(;@水浴;’/63结!果FFF##全溶全溶全溶全溶全溶全溶全溶A?溶A’?溶全不溶全溶全不溶’%!!以完全溶血的溶血素最高稀释倍数为一个溶血单位(表+%&所示为’’’倍(正式试验时(使用两个溶血素单位(则本例溶血素稀释倍数为’’’L&I;A’’倍#D!!#!##!#$#附!录!(&规范性附录’抗原%阳性血清效价滴定方法(%$!取*’支试管(排成纵横各(排的方阵&第(排缺$管’#(%!!抗原和阳性血清分别从$C*$CA$&作倍比稀释(阴性血清作$C)稀释(设抗原%血清和生理盐水对照#(%%!每管按不同稀释度的要求加入阳性血清各’%$/H(抗原对照组一排不加血清(而用’%$/H生理盐水代替#(%&!每管再按不同稀释度的要求(各加入不同稀释倍数的抗原’%$/H(血清对照不加抗原(而用’%$/H生理盐水代替#(%’!每管中加入’%&/H含&单位补体#(%(!摇匀(置)@冰箱感作$DE$*E(次日取出放;@水浴;’/63#(%!每管加入敏化红细胞’%&/H#(%)!混匀(置;@水浴;’/63后(取出静置&E;E(判定结果#(%*!效价判定$能与最高稀释度的阳性血清呈现完全抑制溶血&#’反应的最高抗原稀释度(即为抗原效价&一个工作量’如表B%$所示(抗原效价为$C$&*(阳性血清效价为$C&AD&一个血清工作量’#表(%$!抗原阳性血清滴定结果&举例’抗原稀释倍数血清稀释倍数$C*$C$D$C;&$CD)$C$&*$C&AD$CA$&阴性血清$C)抗原抗补体对照$C*######FFF$C$D######FFF$C;&######FFF$CD)######FF$C$&*######FF$C&AD#####FFF$CA$&###FFFFF血清抗补体对照盐水对照!#!!#!##!#$#