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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准!!#!#!!#$#猪水泡病检疫技术规范$%&’&()*(+,’-)-.-/0-’12*(+3+1*.%/&’4*1+&1+!#$#5$$5#$发布!#$$5#%5#$实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准参考了世界动物卫生组织（ＯＩＥ）《陆生动物诊断试验和疫苗手册（哺乳动物、禽鸟与蜜蜂）》２００８版２．８．９章。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国珠海出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人：杨素、沙才华、朱事康、廖秀云、花群义、林志雄、罗琼、徐海聂。Ⅰ犛犖／犜２７０２—２０１０猪水泡病检疫技术规范１ 范围本标准规定了猪水泡病临床诊断、病毒分离、琼脂扩散试验、反向间接血凝试验、中和试验、单抗阻断酶联免疫吸附试验、反转录聚合酶链反应及荧光反转录聚合酶链反应的操作规程。本标准适用于进出口动物猪水泡病的检疫。２ 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。陆生动物诊断试验和疫苗手册（哺乳动物、禽鸟与蜜蜂（ＯＩＥ２００８版））３ 缩略语下列缩略语适用于本文件。ＢＳＬ３（ｂｉｏｌｏｇｙｓａｆｅｔｙｌａｂｏｒａｔｏｒｙｌｅｖｅｌⅢ）：生物安全三级实验室ＣＰＥ（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃｅｆｆｅｃｔ）：致细胞病变作用Ｃｔ值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数ＤＥＰＣ：焦碳酸乙二酯ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）：酶联免疫吸附试验ＦＭＤＶ（ｆｏｏｔａｎｄｍｏｕｔｈｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ）：口蹄疫病毒ＬＨ（ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ）：水解乳蛋白溶液ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）：聚合酶链式反应ＲＩＨＡ（ｒｅｖｅｒｓｅｉｎｄｉｒｅｃｔｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎａｓｓａｙ）：反向间接血凝试验ＲＴＰＣＲ（ＲＴｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）：反转录聚合酶链反应ＳＮＴ（ｓｅｒｕｍｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎｔｅｓｔ）：中和试验ＳＶＤＶ（ｓｗｉｎｅｖｅｓｉｃｕｌａｒｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ）：猪水泡病病毒ＴＣＩＤ５０（５０％ｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅｉｎｆｅｃｔｉｖｅｄｏｓｅ）：半数组织感染量ＴＴＥ（１，１，２ｔｒｉｃｈｏｒｏｔｒｉｆｌｕｏｒｏｅｔｈａｎｅ）：１，１，２三氯三氟乙烷荧光ＲＴＰＣＲ（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）：荧光反转录聚合酶链反应４ 临床诊断猪水泡病的相关资料参见附录Ａ。猪水泡病病毒（ＳＶＤＶ）属小ＲＮＡ病毒科，肠道病毒属的单股正链ＲＮＡ病毒。能够自然感染ＳＶＤ病毒的只有猪和人类。ＳＶＤ潜伏期为２ｄ～７ｄ，发病猪体温急剧上升可达４１℃，较少引起死亡。水泡性损伤是ＳＶＤ最典型和最具代表性的可视病理变化，损伤多发生在蹄冠部，特别是蹄叉间，并引起蹄壳１犛犖／犜２７０２—２０１０松动，甚至脱壳。水泡偶尔会出现在鼻镜部、嘴唇、舌头、背部和乳头，膝部可见浅表溃疡，感染猪跛行及厌食数天，病猪除口腔、鼻端和蹄部有水泡及水泡破溃后形成溃疡灶外，内脏无明显变化。流产为非典型症状，神经症状较为少见，仔猪较为敏感。该病病程需２周～３周，感染猪恢复后在蹄部可见深色的线状痕迹。临床症状因感染猪的年龄、饲养状况和感染毒株的不同而异，有时呈温和的亚临床感染。本病一年四季均可发生，但多见于冬、春两季。散养发病率低，集中圈养发病率高；一般不引起死亡。传染源为病猪、康复带毒猪和隐性感染猪，病畜的水泡皮、水泡液、粪便、血液以及肠道、毒血症期所有组织含有大量病毒。感染猪的肉屑及泔水；污染的圈舍、车辆、工具、饲料及运动场地均是危险的传染源。本病病毒易通过宿主粘膜（消化道、呼吸道粘膜和眼结膜）和损伤的皮肤感染，孕猪可经胎盘传播给胎儿。受感染猪在出现临床症状前４８ｈ开始通过鼻腔、口腔及排泄物排毒，鼻腔、口腔排毒可持续２周，排泄物排毒可持续３个月。大部分ＳＶＤＶ在猪感染后１ｄ～７ｄ内繁殖。ＳＶＤ病毒在ｐＨ２．５～１２．０范围均较稳定，而ＦＭＤＶ病毒仅在ｐＨ６．０～８．０范围内稳定。通过临床症状表现可初步诊断为ＳＶＤ，但由于ＳＶＤ与ＦＭＤ临床症状和病理变化十分相似，临床上ＳＶＤ与ＦＭＤ的鉴别诊断十分困难，应进行实验室诊断。５ 实验室诊断５．１ 病毒分离５．１．１ 设备、材料和试剂本标准所用试剂、玻璃器皿除有特殊规定外，均需高压灭菌。５．１．１．１ 设备生物安全柜、二氧化碳培养箱、高速冷冻离心机、组织捣碎机、倒置显微镜。５．１．１．２ 器材５ｍＬ耐冷冻密封瓶、２０ｍＬ广口瓶、细胞培养瓶、２４孔细胞培养板、５０ｍＬ离心管、细胞滤网。５．１．１．３ 试剂肝素、７５％酒精、５０％磷酸缓冲甘油、三氯乙烯、氟利昂、聚乙二醇、氯化钠。本标准所用试剂的配制见附录Ｂ，所用试剂除特殊规定外，均指分析纯试剂。５．１．１．４ 细胞ＩＢＲｓ２传代细胞系或其他敏感猪细胞。５．１．２ 样品的采集、保藏和运输５．１．２．１ 采样工具棉拭子、剪刀、镊子、注射器、１．５ｍＬ离心管、研钵、真空采血管、记号笔、低温保藏箱或冰盒等采样工具，应经１２１℃±２℃，２０ｍｉｎ高压灭菌并烘干。５．１．２．２ 水泡液及水泡皮用７５％酒精消毒水泡皮表面，尽量去除污物，再用灭菌生理盐水擦去酒精，然后用无菌注射器穿刺水泡吸取水泡液，置于灭菌瓶中，加入抗生素。采取水泡液后，用无菌手术剪将水泡皮剪下，放入２犛犖／犜２７０２—２０１００．０４ｍｏｌ／ＬｐＨ７．４ＰＢＳ配制的５０％甘油缓冲液，加入抗生素。如果水泡已经破溃，用灭菌生理盐水刷洗掉水泡皮上的污物，然后将水泡皮放入上述甘油缓冲液中，加入抗生素。水泡液及水泡皮均需低温冷冻或放入冰瓶中送检。５．１．２．３ 淋巴结、肌肉及组织脏器无菌采集待检样品后，编号、冷藏送检或低温保藏。从冻肉中分离病毒，可采集淋巴结，尽量去除周围脂肪，保存方法同水泡皮。肌肉及组织脏器应装入一次性塑料袋或其他灭菌容器。５．１．２．４ 全血及血清用无菌方式采取全血，不少于１０ｍＬ，并尽快加入抗凝剂和抗生素，密封后保存于４℃。采集发病动物的全血后，待其康复后再采集一次。用无菌方式采取全血并分离血清，血清量不少于４ｍＬ，加入抗生素，密封后低温冷冻或放入冰瓶中送检。采集发病动物血清后，待其康复后再采集一次血清。５．１．２．５ 口腔分泌物和咽喉拭子用拭子采取口腔分泌物或将拭子深入口腔内来回刮３次～５次取分泌液，拭子一并放入盛有１．０ｍＬ含抗生素的ＰＢＳ缓冲液的１．５ｍＬ离心管中。也可用食道探杯刮取的咽喉液体，放入加有抗生素的ＰＢＳ中。编号，冷藏送检或低温保藏。５．１．２．６ 排泄物采集发病动物排泄物至少２０ｇ，置于０．０４ｍｏｌ／ＬｐＨ７．４ＰＢＳ中，加入抗生素，密封后低温冷冻或放入冰瓶中送检。５．１．３ 样品的处理５．１．３．１ 水泡液无菌采集的新鲜水泡液可不作任何处理，直接使用。若水泡液不清洁，则需１０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ，并加入抗生素。如果水泡液太少，可加入不含血清的细胞培养液稀释，稀释倍数越少越好。５．１．３．２ 水泡皮用ｐＨ７．４ＰＢＳ漂去水泡皮上的污物，用灭菌滤纸吸干水分，称量后按质量∶体积加入４倍不含血清的细胞培养液或ＰＢＳ，加少许石英砂研磨，于４℃浸毒过夜，然后１０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ，取上清液用于病毒分离。５．１．３．３ 淋巴结淋巴结中的病毒含量较少，需浓缩处理。用ｐＨ７．４ＰＢＳ漂去污物，用灭菌滤纸吸干水分，称量后按质量∶体积加入９倍不含血清的细胞培养液或ＰＢＳ，加少许石英砂研磨，于４℃浸毒过夜，然后１０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ，取上清液加入２倍体积的预冷的三氯乙烯，充分振荡，１０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ，取水相，１３０００ｒ／ｍｉｎ离心９０ｍｉｎ，按原淋巴悬液１／２５的量加入不含血清的细胞培养液，充分悬浮管底，用于病毒分离。如果无超速离心条件，用终浓度８％（质量浓度）的聚乙二醇６０００和４％（质量浓度）的氯化钠沉淀浓缩组织浸出液中的病毒。首先使其充分搅拌溶解，于４℃过夜，然后８０００ｒ／ｍｉｎ离心６０ｍｉｎ，弃去液相，按原淋巴悬液１／２５的量加入不含血清的细胞培养液，充分悬浮管底，用于病毒分离。３犛犖／犜２７０２—２０１０５．１．３．４ 排泄物将排泄物置于０．０４ｍｏｌ／ＬｐＨ７．４ＰＢＳ中，于４℃浸毒过夜，然后１００００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｍｉｎ，收集上清液，用于病毒分离。２８０００ｒ／ｍｉｎ离心３ｈ（可浓缩上清液中任何低浓度病毒），弃上清液，用２ｍＬＰＢＳ重悬沉淀，加入等量的氟利昂，４０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清用于病毒分离。５．１．４ 用细胞分离犛犞犇犞当ＩＢＲｓ２细胞长成单层时，弃去细胞培养液，用不含血清的细胞培养液冲洗细胞单层２次，接种经过处理的样品（以能淹没细胞单层为宜），于３７℃吸附１ｈ，然后补加不含血清的细胞培养液于３７℃培养，同时设立正常细胞对照。每天于倒置显微镜下观察２次，４８ｈ进行终判。当正常细胞对照成立，接种样品细胞出现圆缩、脱落，即为典型的ＣＰＥ，将细胞冻融２次后离心，取上清液进行进一步鉴定。如果４８ｈ内未出现ＣＰＥ，则需盲传３代（必要时应盲传１０代），若盲传后仍未出现ＣＰＥ，则判为ＳＶＤＶ阴性。５．１．５ 用犛犘犉乳鼠分离犛犞犇犞每份样品接种４只１ｄ～２ｄ龄的ＳＰＦ乳鼠，每只背部皮下接种０．１ｍＬ～０．２ｍＬ，接种后观察５ｄ，５ｄ内出现神经症状或死亡者，剥皮，去头和内脏，将肌肉和骨骼一起称量，按质量∶体积加入９倍不含血清的细胞培养液或ＰＢＳ，加少许石英砂研磨，于４℃浸毒过夜，１０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液用于进一步鉴定。如果５ｄ内未出现神经症状或死亡，则需用ＳＰＦ乳鼠盲传３代（必要时应盲传１０代），若盲传后仍未出现神经症状或死亡，则判为ＳＶＤＶ阴性。５．１．６ 培养物的鉴定收获的培养物应进行鉴定，鉴定可使用病毒中和试验、单抗ＥＬＩＳＡ和反转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）等方法。５．２ 琼脂凝胶免疫扩散试验５．２．１ 设备、器材和试剂５．２．１．１ 设备打孔器、微量注射器或加样移液器、印相暗盒或台灯。５．２．１．２ 器材平皿（直径６．０ｃｍ）。５．２．１．３ 试剂本标准试剂除特殊规定外，均指分析纯试剂。５．２．１．３．１ 琼扩抗原、标准阳性血清。５．２．１．３．２ 琼脂糖。５．２．１．３．３ 琼脂糖凝胶缓冲液（ＡＧＢ），饱和硫酸铵，ｐＨ７．２、０．０１ｍｏｌ／Ｌ的磷酸盐缓冲液（ｐＨ７．２、０．０１ｍｏｌ／Ｌ的ＰＢＳ），配制方法见附录Ｂ。５．２．２ 操作方法５．２．２．１ 琼脂糖平板制备取琼脂糖１．０ｇ加入９９ｍＬＡＧＢ，１１５℃１０ｍｉｎ融化灭菌。吸取８ｍＬ琼脂液加到直径６ｃｍ的平４犛犖／犜２７０２—２０１０皿内，制成３ｍｍ厚的琼脂板。待琼脂冷却凝固后加盖置于湿盒中，放４℃冰箱备用。５．２．２．２ 打孔孔径、孔距均为３ｍｍ，按图１所示式样打孔。用针头将孔内的凝块挑出，并用酒精灯加热平皿底面封底。图１ 打孔式样５．２．２．３ 被检血清样品的处理检疫用样品５６℃水浴灭活３０ｍｉｎ。吸取被检血清０．４ｍＬ，加ｐＨ７．２、０．０１ｍｏｌ／Ｌ的ＰＢＳ０．４ｍＬ，混匀，逐滴加入饱和硫酸铵０．２ｍＬ，摇匀，室温静置２０ｍｉｎ，８０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ；取上清液，逐滴加入饱和硫酸铵０．２ｍＬ，摇匀，室温静置２０ｍｉｎ，８０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，沉淀物用０．２ｍＬ～０．４ｍＬｐＨ７．２、０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ重新悬浮，此悬浮液供正式试验用。５．２．２．４ 加样每４份被检样品取５块平皿，按图２所示方式加样