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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准!!#!#$!$#$山羊传染性胸膜肺炎检疫技术规范$%&’&()*(+,’-)-.-/0-’.-()&1*-%2.&,’*(+,/+%’-,(+%3-(*&!$#$4##4$#发布!$##4$%4$#实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前!!言!!本标准按照!!#$%$&’’(给出的规则起草#本标准修改采用$陆生动物诊断试验与疫苗手册%&&’’(版’第&%)%*章#本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口#本标准起草单位(中华人民共和国山东出入境检验检疫局#本标准主要起草人(郑小龙)梁成珠)朱来华)孙敏)徐彪)邓明俊)岳志芹)肖西志#!!!#!#$!$#$山羊传染性胸膜肺炎检疫技术规范#!范围本标准规定了山羊传染性胸膜肺炎的病原分离与鉴定)微量间接血凝试验)补体结合试验和聚合酶链式反应&+,-’技术#本标准适用于山羊传染性胸膜肺炎的诊断和检疫#!!规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的#凡是注日期的引用文件*仅注日期的版本适用于本文件#凡是不注日期的引用文件*其最新版本&包括所有的修改单’适用于本文件#!!#.)/(%&/&’’0!食品微生物学检验!染色法)培养基和试剂%!临床诊断%%#!临床症状山羊传染性胸膜肺炎的典型特征是极度高热&.$1.01’*发病率和死亡率很高*妊娠山羊易流产#在高热约&202后*出现明显的呼吸症状(呼吸加速*状态痛苦*偶尔出现呼噜声*持续性地剧烈咳嗽#在病程后期山羊失去运动能力前腿分开站立*颈项僵硬前伸*有时候嘴里不断地流出涎液#%%!!判定根据临床症状可以作出初步判定#如要确诊需送实验室做进一步检查#&!病原分离鉴定&%#!设备和器材生化培养箱)显微镜)无菌棉拭子)载玻片)灭菌平皿)灭菌试管和试管架)酒精灯#&%!!培养基和试剂$’3马血清马丁肉汤)$’3马血清马丁琼脂*见附录4#生化用培养基(按!!#.)/(%&/&’’0中第0章的规定#&%%!样品的采集与处理&%%%#!用无菌棉拭子采集患病动物鼻腔分泌物*移入含抗生素&青霉素$’’5!67和链霉素$’’#8!67’的灭菌生理盐水中+或用注射器无菌穿刺采取胸腔液#&%%%!!无菌采集死亡动物的胸水和纵隔淋巴结*以及肺病变部的病料*特别是硬变部位和非硬变部位交界处的样品#&%%%%!采集样品应尽快低温&’1.1’运往实验室*如无法立即送往实验室*应将样品置于9&’1冷冻保存#$!!#!#$!$#$&%&!病原分离培养在无菌条件下剪碎病料*用无菌接种环钩取样品接种于$’3马血清马丁肉汤内+鼻腔拭子浸出液和胸腔液用灭菌吸管吸取’%$67’%067接种于$’3马血清马丁肉汤*接种后置0)1培养#同时取上述病料在$’3马血清马丁琼脂平板上划线接种*平板用胶布封口*置0)1:3二氧化碳培养箱中培养#每天检查肉汤培养物生长情况即颜色变化和有无絮状物出现#肉眼观察出现混浊时*表示有细菌污染*应将培养物经孔径’%.:#6的滤膜过滤后再移植*用$!$’的量接种于肉汤培养基或用接种环钩取培养物在琼脂平板上划线培养#在平板上培养$.2*每$202用解剖镜&放大:倍:’倍’配以透射和入射光源检查一次+继代时切下带有孤立菌落的琼脂块*表面朝下*在新鲜琼脂平板表面上并稍推动*或将其投入新鲜肉汤培养基内#也可用巴氏吸管将带有单个菌落的琼脂块吸出*在新鲜肉汤培养基中培养#作初次分离用的肉汤培养基接种后培养)2*如果仍不见生长迹象*要进行盲传#每份样品的培养物*包括一次盲传继代至少检查0周后*方可废弃#&%’!结果判定&%’%#!培养特征在低次代中*固体培养基上可产生畸形菌落*小型)无芯)形状不规则#经过传代*形成圆形)露滴状的小菌落*直径$66066*大小不一+在.’倍显微镜下可看见典型的煎蛋样菌落*部分有脐眼#挑取典型菌落或取肉汤培养物涂片*用瑞氏染色法进行染色*显微镜下可看到大小不一)形态多样的紫色小点*有圆形)逗点形)棒形)环形和不规则形等*但以圆形居多#&%’%!!生化特征分别接种各类生化反应培养基*具体的生化反应内容见表$#表#!生化反应特征项!!目生化特性项!!目生化特性发酵葡萄糖;膜斑形成水解精氨酸9液化血清;分解尿素9吸附鸡红细胞9还原美蓝;溶血素测定;!!注(;(阳性!9(阴性#’!微量间接血凝试验’%#!仪器设备分析天平)离心机)=型血凝板)微量振荡器):’#7可调移液器)恒温箱等#’%!!试剂和材料标准抗原)标准阳性血清和标准阴性血清)磷酸盐缓冲液&+?@)%&’)阿氏液&试剂配制见附录4’*$3致敏绵羊红细胞&见附录’#&!!#!#$!$#$’%%!操作方法’%%%#!微量间接血凝试验操作术式见表&#在=型微量血凝板上*每孔加+&:#7#表!!微量间接血凝试验操作术式单位为微升’%%%!!每排第$孔加血清&:#7*反复吹打充分混匀*移出&:#7至第&孔+吹打混匀*移出&:#7至第0孔*依次类推作等量倍比稀释至第$$孔*第$$孔弃去&:#7#孔$&不加血清设立为红细胞对照*同时设立阳性血清和阴性血清对照孔#’%%%%!每孔加入$3致敏绵羊红细胞悬浮液&:#7*立即置微型振荡器上振荡或手持血凝板绕圆圈混匀#’%%%&!置湿盒中0)1静置$A或室温&约&’1’下静置&A左右*判定结果#’%&!结果判定’%&%#!阴性对照和红细胞对照应无凝集现象*红细胞沉积呈圆形*边缘整齐#阳性对照应出现全部红细胞或:’3红细胞凝集#’%&%!!!($’’3红细胞凝集*凝集颗粒均匀地分布在整个孔底*呈薄状+;;;():3红细胞凝集*孔底红细胞呈滴状*凝集边缘不整齐+;;(:’3红细胞凝集*孔底形成环状*周围有凝集颗粒*但不成膜状+;(&:3红细胞凝集*孔底形成一个小团*但小团边缘不整齐*周围有少量凝集+9(红细胞完全不凝集*红细胞在孔底形成小团*小团边缘整齐*周围无凝集颗粒#若各对照组成立*试验结果可信*以被检血清出现:’3红细胞凝集&;;’的血清最高稀释度作为其抗体效价#’%&%%!被检血清抗体效价$B/时判为阳性+被检血清抗体效价#$B/时判为阴性#(!补体结合试验(%#!材料与仪器(%#%#!被检血清(见附录#(%#%!!绵羊红细胞(见附录#(%#%%!补体#(%#%&!山羊传染性胸膜肺炎阴性血清)阳性血清#(%#%’!山羊传染性胸膜肺炎补体结合抗原#(%#%(!溶血素#(%#%!稀释液(巴比妥缓冲液&见附录4’#(%#%)!(*孔5型微量滴定板)酶标仪#0!!#!#$!$#$(%!!预备试验&溶血素)补体)抗原等效价测定’(%!%#!溶血素效价测定&通常一个月左右测定一次’(%!%#%#!稀释溶血素(先将溶血素稀释成$B$’’的基础液&如(溶血素以石炭酸防腐时*取’%$67加(%(67稀释液*如以甘油为保存液*则取’%&67加(%/67稀释液*混合均匀’*再按表0进一步稀释#表%!溶血素稀释法要!!素稀释倍数&$BC’:’’$’’’$:’’&’’’&:’’0’’’0:’’.’’’:’’’$B$’’溶血素!67’%&’%$’%$’%$’%$’%$’%$’%$’%$稀释液!67’%/’%($%.$%(&%.&%(0%.0%(.%(全量!67$%’$%’$%:&%’&%:0%’0%:.%’:%’(%!%#%!!溶血素效价测定的方法*按表.#表&!溶血素效价测定法&总体积#!’!$’要!!素稀释倍数&$BC’对照:’’$’’’$:’’&’’’&:’’0’’’0:’’.’’’:’’’$B:’’溶血素补体红细胞稀释的溶血素!#7&:&:&:&:&:&:&:&:&:&:稀释液!#7:’:’:’:’:’:’:’:’:’):):$’’$B&’补体!#7&:&:&:&:&:&:&:&:&:&:&%:3红细胞悬液!#7&:&:&:&:&:&:&:&:&:&:&:&:温育0)1水浴&’6DE!!按表.操作结束后*取出微量反应板*对照不出现溶血现象#微量反应板轻微震动混匀后*:.’E6读取FG值*与标准比色孔&见附录,’比较*观察溶血度*记录结果#(%!%#%%!溶血素效价确定(能使&:#7的&%:3红细胞悬液在0)1水浴箱内&’6DE出现完全溶血&$’’3’的最小溶血素量*称为一个溶血素单位*或溶血素效价#测定补体)抗原和做正式试验时*溶血素的用量为&个溶血素单位或称工作量#(%!%#%&!制备致敏红细胞悬液(按测定的溶血素效价稀释溶血素至&个标准单位*缓慢加入到等量的&%:3绵羊红细胞悬浮液中*混合均匀*置0)1水浴箱中温育&’6DE*即制备成致敏红细胞悬液#(%!%!!补体效价测定每次进行补体结合反应试验*应于当日测定补体效价#先用稀释液*将补体做$B&’稀释*然后按表:进行操作#表’!补体效价测定&总体积#!’!$’要!!素孔!!号对照$&0.:*)/($’$$$B&’补体!#7:$’$:&’&:0’0:.’.::’.!!#!#$!$#$表’&续’要!!素孔!!号对照$&0.:*)/($’$$稀释液!#7.:.’0:0’&:&’$:$’:’:’补加稀释液!#7&:&:&:&:&:&:&:&:&:&:&:温育0)1水浴&’6DE致敏红细胞!#7:’:’:’:’:’:’:’:’:’:’:’温育0)1水浴&’6DE!!按表:操作结束后*取出微量反应板*对照不出现溶血现象#微量反应板轻微振动混匀后*:.’E6读取FG值*与标准比色孔&见附录,’比较*确定出现:’3溶血时补体的最高稀释倍数为补体的效价*即该浓度为此反应体系下$个补体溶血单位&,@:’’#正式试验补体工作浓度为:个,@:’#(%!%%!抗原效价的测定按表*进行抗原效价的测定#表(!抗原效价测定&总体积#!’!$’要!!素抗原稀释倍数对照$B$’$B:’$B):$B$’’$B$:’$B&’’$B0’’$B.’’$B:’’$B$’稀释的抗原!#7&:&:&:&:&:&:&:&:&:&:稀释的阳性血清!#7&:&:&:&:&:&:&:&:&:0)1水浴&’6DE:,@:’补体!#7&:&:&:&:&:&:&:&:&:&:稀释液!#7&:温育0)1水浴&’6DE致敏红细胞!#7:’:’:’:’:’:’:’:’:’:’温育0)1水浴&’6DE!!注(每一血清稀释度&$B:*$B$’*$B&:*$B:’*$B):*$B$’’’各做一行*共计*行#!!按表*操作结束后*取出微量反应板*对照不出现溶血现象#微量反应板轻微振动混匀后*:.’E6读取FG值*与标准比色孔&见附录,’比较*观察溶血度*记录结果#抗原效价的确定(在对照成立时*与阳性血清各稀释度发生抑制溶血最强的抗原最高稀释度为抗原效价*即为$个单位抗原*正式试验抗原使用&个单位*即为该抗原的工作浓度#(%%!正式试验(%%%#!要素准备按*%&的测定结果对各要素作稀释#被检血清&见附录’#工作抗原(按测定的效价稀释成工作浓度&&单位抗原’*用&:#7#:!!#!#$!$#$工作补体(按测定的效价稀释后工作浓度&:,@:’’*用&:#7#致敏红细胞悬液&见*%&%$%.’(用:’#7#阳性血清(灭活后*$B:稀释*用&:#7#阴性血清(灭活后*$B:稀释*用&:#7#(%%%!!血清效价测定按表)的程序实施#表!血清效价测定&总体积#!’!$’要!!素血清试验孔血清抗补体对照$BC:$’&’.’/’$*’0&’:抗原对照补体对照抑制溶血溶血对照&,@:’$,@:’红细胞对照血清!#7&:&:&:&:&:&:&:&:&单位抗原!#7&:&:&:&:&:&:&:&:&:稀释液!#7&:&:&::’*&%:):0)1水浴&’6DE:,@:’补体!#7&:&:&:&:&:&:&:&:&:&:$&%:温育0)1水浴&’6DE致敏红细胞!#7:’:’:’:’:’:’:’:’:’:’:’:’:’温育0)1水浴&’6DE(%%%%!结果判定(%%%%%#!试验成立条件按表)操作结束后*取出微量反应板*轻微振动混匀后*:.’E6读取FG值*比照标准比色孔&附录,’判读*各对照的结果如下时*可判定被检血清孔+否则*