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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２６７６—２０１０进出口粮谷中犜２毒素的检测方法酶联免疫吸附法犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犜２犻狀犮犲狉犲犪犾狊犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋—犈狀狕狔犿犲犾犻狀犽犲犱犻犿犿狌狀狅狊狅狉犫犲狀狋犪狊狊犪狔２０１０１１０１发布２０１１０５０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：孙静克、鲍蕾、张艺兵、吕宁、吴振兴、金莹、田娟、许艳丽。Ⅰ犛犖／犜２６７６—２０１０进出口粮谷中犜２毒素的检测方法酶联免疫吸附法１ 范围本标准规定了进出口粮谷中Ｔ２毒素的酶联免疫吸附检测方法。本标准适用于大麦、小麦、高粱、玉米中Ｔ２毒素的检测。２ 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法３ 方法提要本方法的测定是基于竞争性酶联免疫反应，用甲醇／水振荡提取粉碎样品中的Ｔ２毒素。处理后样品中的Ｔ２毒素与Ｔ２毒素酶标记物竞争结合至包被在微孔板上的抗体。通过洗涤除去微孔上未结合的Ｔ２毒素与Ｔ２毒素酶标记物，然后加入反应底物，用酶标仪测定吸光度，根据吸光度值得出试样中的Ｔ２毒素含量。４ 试剂和材料除注明外，所用化学试剂均为分析纯，水为ＧＢ／Ｔ６６８２规定的一级水。４．１ Ｔ２毒素检测试剂盒（参见附录Ａ）。４．２ 甲醇。４．３ 甲醇水提取液：用甲醇和水以７∶３的比例配制成提取液备用。４．４ Ｔ２毒素标准品：纯度大于等于９８％。４．５ Ｔ２毒素标准品溶液的配制：用乙腈作为溶剂配制成２００μｇ／ｍＬ的储备液，于－４℃条件下保存。４．６ ｐＨ值为７．２的样品稀释用磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ缓冲液）：分别称取０．５５ｇ磷酸二氢钠（ＮａＨ２ＰＯ４·Ｈ２Ｏ），２．８５ｇ磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４·２Ｈ２Ｏ）和９ｇ氯化钠，用水溶解并定容至１Ｌ。如果毒素含量较高，需要更高倍稀释时（大于１∶７），应向此缓冲液中加入１０％的甲醇溶液，以保证甲醇溶液的浓度为１０％。５ 仪器和设备５．１ 天平：感量０．０１ｇ。５．２ 均质器。５．３ 涡旋混合器。５．４ 微量移液器：５μＬ～５０μＬ，１０μＬ～１００μＬ，０μＬ～１０００μＬ。１犛犖／犜２６７６—２０１０５．５ 多通道微量移液器：５０μＬ～３００μＬ。５．６ 容量瓶：１０ｍＬ，１０００ｍＬ。５．７ 酶标仪。５．８ 粉碎机。５．９ 离心机：５０００ｒ／ｍｉｎ。６ 试样的制备与保存６．１ 试样的制备将样品按四分法缩分至１ｋｇ，全部磨碎至颗粒可通过２０目筛大小，混匀，均分成两份作为试样，分别装入清洁的容器内，密封，并标明标记。在抽样和制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。６．２ 试样的保存将试样于－５℃以下避光保存。７ 分析步骤７．１ 提取称取２５ｇ试样（精确到０．０１ｇ），加入１２５ｍＬ甲醇水提取液（４．３），均质１ｍｉｎ～２ｍｉｎ，５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ。离心后取５０μＬ滤液加入３００μＬ样品稀释液，混匀。取５０μＬ进行酶联免疫测定，最后稀释倍数为３５。高浓度的样品，毒素含量如超出标准曲线范围，可进一步稀释，直至样品中毒素浓度在标准曲线范围以内。７．２ 测定条件７．２．１ 操作条件所有操作应在室温下（２０℃～２４℃）进行，Ｔ２毒素试剂盒中所有试剂的温度均应回升至室温（２０℃～２４℃）后方可使用。７．２．２ 洗板条件人工洗涤次数５次以上，每次加入洗涤液量为２５０μＬ，自动洗板可以预定５次。７．２．３ 酶标仪测定条件酶标仪测定波长为４５０ｎｍ。７．３ 测定步骤７．３．１ 将测定需用的微孔条插入微孔架，记录标准液和样液在微孔架上的位置。７．３．２ 吸取５０μＬＴ２毒素标准液（浓度分别为０、０．１、０．２、０．４、０．８、１．６ｎｇ／ｍＬ）和样液至各微孔。７．３．３ 吸取５０μＬＴ２毒素酶标记物至各微孔，均匀混合，依次加入５０μＬＴ２毒素抗体，混合，以封口膜将微孔覆盖防止试液挥发，于２２℃～２５℃黑暗避光处孵育１ｈ。７．３．４ 倒出孔中液体，以２５０μＬ蒸馏水反复清洗微孔，重复操作３次以上，将微孔倒置在吸水纸上拍打数次，以保证完全除去微孔中洗液。２犛犖／犜２６７６—２０１０７．３．５ 迅速加入１００μＬ底物至各微孔，于２２℃～２５℃黑暗避光处孵育３０ｍｉｎ。７．３．６ 孵育完毕后加入１００μＬ反应停止液至各微孔，充分混匀，上酶标仪测量并记录每个微孔试液４５０ｎｍ波长处的吸光度值（加入反应终止液后应在３０ｍｉｎ内读取吸光度）。７．４ 平行试验按以上步骤，对同一标准溶液、同一样品溶液均应进行平行试验测定。７．５ 空白试验除不称取试样外，均按上述步骤进行。７．６ 阳性质控每次测定均应做一个添加自配Ｔ２毒素标准品溶液（４．５）的监控样品。以确定实验过程的操作准确性。８ 结果计算标准品和样品的ＯＤ平均值除以零标准（犃１、犃２）的平均ＯＤ值，再乘以１００，计算出各标准液和样品的百分比吸光度值。零标准为１００％（最大吸光度值），其他ＯＤ值为最大吸光度值的百分数。以吸光度的百分比值（犅／犅０）为纵坐标（％），Ｔ２毒素标准溶液浓度（ｎｇ／ｍＬ）的对数值为横坐标绘制标准工作曲线。从标准工作曲线上得到试样中相应的Ｔ２毒素浓度后，结果按式（１）进行计算。犡＝犮×犞×１０００犿×１０００…………………………（１） 式中：犡———样品中Ｔ２毒素的残留量，单位为微克每千克（μｇ／ｋｇ）；犮———从标准工作曲线上得到的样品中Ｔ２毒素浓度，单位为纳克每毫升（ｎｇ／ｍＬ）；犞———样品溶液的最终定容体积，单位为毫升（ｍＬ）；犿———样品溶液所代表的最终试样质量，单位为克（ｇ）。也可以用各种酶标仪的数据处理软件进行计算。注：计算结果扣除空白值，所得结果保留一位小数。９ 确证试验如被测样品中Ｔ２毒素含量的值大于限量要求时，应用其他方法进行确证。１０ 本方法测定低限、回收率、精密度１０．１ 测定低限本方法的测定低限为３．５μｇ／ｋｇ。１０．２ 回收率本方法Ｔ２毒素添加浓度和回收率实验数据：———添加量为３．５μｇ／ｋｇ时，回收率为８０．９％～９０．０％；———添加量为１４μｇ／ｋｇ时，回收率为８９．３％～９６．４％；３犛犖／犜２６７６—２０１０———添加量为５６μｇ／ｋｇ时，回收率为９０．４％～９７．０％；———添加量为１００μｇ／ｋｇ时，回收率为９８．５％～１０６．４％。１０．３ 精密度本方法在大麦中的精密度为７．０％～１１．３％，在高粱中的精密度为５．６％～１１．４％，在小麦中的精密度为４．５％～１５．３％，在玉米中的精密度为８．２％～１６．０％。４犛犖／犜２６７６—２０１０附 录 犃（资料性附录）德国犚犅犻狅狆犺犪狉犿试剂盒１）犃．１ 试剂和组成犃．１．１ 包被有抗体的微孔条，１２条×８孔。犃．１．２ Ｔ２毒素标准液（浓度分别为０、０．１、０．２、０．４、０．８、１．６ｎｇ／ｍＬ）。犃．１．３ Ｔ２毒素酶标记物。犃．１．４ Ｔ２毒素抗体。犃．１．５ 底物。犃．１．６ 样品稀释缓冲液。犃．１．７ 反应停止液。试剂盒应在２℃～８℃避光条件下保存。犃．２ 标准校正曲线标准校正曲线见图Ａ．１。图犃．１ 标准校正曲线１） 给出该信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对某一产品的认可。如果其他产品具有相同的效果，需经实验评估后使用这些等效产品。５犛犖／犜２６７６—２０１０犉狅狉犲狑狅狉犱犜犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱狑犪狊狆狉狅狆狅狊犲犱犫狔犪狀犱犻狊狌狀犱犲狉狋犺犲犮犺犪狉犵犲狅犳狋犺犲犮犲狉狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀犪狀犱犪犮犮狉犲犱犻狋犪狋犻狅狀犃犱犿犻狀犻狊狋狉犪狋犻狅狀狅犳狋犺犲犘犲狅狆犾犲’狊犚犲狆狌犫犾犻犮狅犳犆犺犻狀犪．犜犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱狑犪狊犱狉犪犳狋犲犱犫狔犛犺犪狀犱狅狀犵犈狀狋狉狔犈狓犻狋犐狀狊狆犲犮狋犻狅狀犪狀犱犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲犅狌狉犲犪狌狅犳狋犺犲犘犲狅狆犾犲’狊犚犲狆狌犫犾犻犮狅犳犆犺犻狀犪．犜犺犲犿犪犻狀犱狉犪犳狋犲狉狊狅犳狋犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱犪狉犲犛狌狀犼犻狀犵犽犲，犅犪狅犾犲犻，犣犺犪狀犵狔犻犫犻狀犵，犔ü狀犻狀犵，犠狌狕犺犲狀狓犻狀犵，犑犻狀狔犻狀犵，犜犻犪狀犼狌犪狀，犡狌狔犪狀犾犻．６犛犖／犜２６７６—２０１０犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犜２犻狀犮犲狉犲犪犾狊犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋—犈狀狕狔犿犲犾犻狀犽犲犱犻犿犿狌狀狅狊狅狉犫犲狀狋犪狊狊犪狔１ 犛犮狅狆犲犜犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱狊狆犲犮犻犳犻犲狊狋犺犲犿犲狋犺狅犱狅犳狊犪犿狆犾犲狆狉犲狆犪狉犪狋犻狅狀犪狀犱犱犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀犫狔犈犔犐犛犃犿犲狋犺狅犱狅犳犜２狋狅狓犻狀犻狀犮犲狉犲犪犾狊犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋．犜犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱犻狊犪狆狆犾犻犮犪犫犾犲狋狅狋犺犲犳犪狊狋犱犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犜２狋狅狓犻狀犻狀犫犪狉犾犲狔，狑犺犲犪狋，狊狅狉犵犺狌犿犪狀犱犮狅狉狀．２ 犖狅狉犿犪狋犻狏犲狉犲犳犲狉犲狀犮犲狊犜犺犲犳狅犾犾狅狑犻狀犵狀狅狉犿犪狋犻狏犲犱狅犮狌犿犲狀狋狊犮狅狀狋犪犻狀狆狉狅狏犻狊犻狅狀狑犺犻犮犺，狋犺狉狅狌犵犺狉犲犳犲狉犲狀犮犲犻狀狋犺犻狊狋犲狓狋，犮狅狀狊狋犻狋狌狋犲狊狆狉狅狏犻狊犻狅狀狅犳狋犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱．犉狅狉犱犪狋犲犱狉犲犳犲狉犲狀犮犲狊，狊狌犫狊犲狇狌犲狀狋犪犿犲狀犱犿犲狀狋狊（犲狓犮犾狌犱犲犮狅狉狉犲犮狋犻狅狀）狋狅，狅狉狉犲狏犻狊犻狅狀狊狅犳，犪狀狔狅犳狋犺犲狊犲狆狌犫犾犻犮犪狋犻狅狀狊犱狅狀狅狋犪狆狆犾狔．犎狅狑犲狏犲狉狆犪狉狋犻犲狊狋狅犪犵狉犲犲犿犲狀狋狊犫犪狊犲犱狅狀狋犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱犪狉犲犲狀犮狅狌狉犪犵犲犱狋狅犻狀狏犲狊狋犻犵犪狋犲狋犺犲狆狅狊狊犻犫犻犾犻狋狔狅犳犪狆狆犾狔犻狀犵狋犺犲犿狅狊狋狉犲犮犲狀狋犲犱犻狋犻狅狀狊狅犳狋犺犲狀狅狉犿犪狋犻狏犲犱狅犮狌犿犲狀狋狊犻狀犱犻犮犪狋犲犱犫犲犾狅狑．犉狅狉狌狀犱犪狋犲犱狉犲犳犲狉犲狀犮犲狊，狋犺犲犾犪狋犲狊狋犲犱犻狋犻狅狀狅犳狋犺犲狀狅狉犿犪狋犻狏犲犱狅犮狌犿犲狀狋狉犲犳犲狉狉犲犱狋狅犪狆狆犾犻犲狊．犌犅／犜６６８２ 犠犪狋犲狉犳狅狉犪狀犪犾狔狋犻犮犪犾犾犪犫狅狉犪狋狅狉狔狌狊犲—犛狆犲犮犻犳犻犮犪狋犻狅狀犪狀犱狋犲狊狋犿犲狋犺狅犱狊３ 犘狉犻狀犮犻狆犾犲犜犺犲犫犪狊犻狊狅犳狋犺犲狋犲狊狋犻狊狋犺犲犪狀狋犻犵犲狀犪狀狋犻犫狅犱狔狉犲犪犮狋犻狅狀．犜犺犲犿犻犮狉狅狋犻狋犲狉狑犲犾犾狊犪狉犲犮狅犪狋犲犱狑犻狋犺犮犪狆狋狌狉犲犪狀狋犻犫狅犱犻犲狊犱犻狉犲犮狋犲犱犪犵犪犻狀狊狋犪狀狋犻犜２狋狅狓犻狀犪狀狋犻犫狅犱犻犲狊．犜犺犲狊狋犪狀犱犪狉犱狊，狋犺犲狊犪犿狆犾犲狊犪狀犱狋犺犲犲狀狕狔犿犲犮狅狀犼狌犵犪狋犲犪狉犲犪犱犱犲犱狋狅狋犺犲犿犻犮狉狅狆犾犪狋犲狑犲犾犾狊．犇狌狉犻狀犵狋犺犲犳犻狉狊狋犻狀犮狌犫犪狋犻狅狀，狋犺犲狉犲犻狊犪犮狅犿狆犲狋犻狋犻狅狀犪犿狅狀犵狋犺犲犳狉犲犲犿狅犾犲犮狌犾犲狊，犾犻犽犲犜２，狋犺犲狊狋犪狀犱犪狉犱狊狅狉狊犪犿狆犾犲狊犪狀犱狋犺犲犲狀狕狔犿犲（犲狀狕狔犿犲犮狅狀犼狌犵犪狋犲）犳狅狉狋犺犲犫犻狀犱犻狀犵狊犻狋犲狊狅犳狋犺犲犪狀狋犻犜２犪狀狋犻犫狅犱狔犪犱狊狅狉犫犲犱狋狅狋犺犲狊狅犾犻犱狆犺犪狊犲．犃犳狋犲狉狋犺犲狑犪狊犺犻狀犵狊狋犲狆，犪狀狔狌狀犫狅狌狀犱犿狅犾犲犮狌犾犲犻狊狉犲犿狅狏犲犱．犜犺犲犫狅狌狀犱犲狀狕狔犿犲犪犮狋犻狏犻狋狔犻狊犱犲狋犲狉犿犻狀犲犱犫狔犪犱犱犻狀犵犪狀犪犿狅狌狀狋狅犳犮犺狉狅犿狅犵犲狀狊狌犫狊狋狉犪狋犲．犜犺犲犪犱犱犻狋犻狅狀狅犳狋犺犲狊狋狅狆狉犲犪犵犲狀狋犾犲犪犱狊狋狅犪犮狅犾狅狉犮犺犪狀犵犲犳狉狅犿犫犾狌犲狋狅狔犲犾犾狅狑．犜犺犲犪犫狊狅狉犫犪狀犮犲