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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２６５７—２０１０国境口岸组织胞浆菌检验方法犈狓犪犿犻狀犪狋犻狅狀犳狅狉犎犻狊狋狅狆犾犪狊犿犪犪狋犳狉狅狀狋犻犲狉狆狅狉狋２０１０１１０１发布２０１１０５０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广西出入境检验检疫局。本标准主要起草人：吴文旺、谭勇、胡慧宁、陆建新、潘光合、方晋。Ⅰ犛犖／犜２６５７—２０１０国境口岸组织胞浆菌检验方法１ 范围本标准规定了国境口岸组织胞浆菌的检验对象、方法、结果报告及阳性结果的处置。本标准适用于国境口岸组织胞浆菌的实验室检验。２ 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ１９４８９ 实验室 生物安全通用要求Ｄｏｃ９２８４ＡＮ／９０５ 危险物品安全航空运输技术细则（２００７年～２００８年）３ 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。３．１组织胞浆菌 犎犻狊狋狅狆犾犪狊犿犪组织胞浆菌属真菌界半知菌亚门丝孢菌纲丝孢菌目从梗孢科，为双相型真菌，在２５℃条件下培养为霉菌相，在３５℃培养及组织内为酵母相。对人类具有病原性的有荚膜组织胞浆菌和组织胞浆菌杜波变种。３．２组织胞浆菌病 犺犻狊狋狅狆犾犪狊犿狅狊犻狊组织胞浆菌引起的感染性真菌病。通常经呼吸道传染，侵犯肺部引起急慢性肺部损害，临床主要表现为发热、咳嗽、咯血、胸痛、呼吸困难、盗汗、消瘦，严重者可引起全身播散，主要累及单核巨噬细胞系统，如肝、脾、骨髓、淋巴结等；也可侵犯肾上腺、皮肤、胃肠道等。该病遍及全球，主要流行于温带地区。４ 对象４．１ 来自流行区的出入境人员。４．２ 国境口岸可疑组织胞浆菌病病人。４．３ 申请检验的其他人员。５ 准备５．１ 器材与试剂实验室检验常用器材参见附录Ａ，培养基和试剂参见附录Ｂ。５．２ 实验室生物安全实验室生物安全符合ＧＢ１９４８９的规定。大量活菌操作，在生物安全三级（ＢＳＬ３）实验室进行；动１犛犖／犜２６５７—２０１０物感染实验，在动物生物安全三级（ＡＢＳＬ３）实验室进行。标本检测，包括样本的病原菌分离纯化、药物敏感性试验、生化鉴定、免疫学实验、涂片、显微观察等初步检测活动，在生物安全二级（ＢＳＬ２）实验室进行。标本或活菌培养物运输应符合国际民用航空组织Ｄｏｃ９２８４ＡＮ／９０５中Ａ类传染性物质的要求。６ 标本采集和处理６．１ 血液标本静脉采血１５ｍＬ，其中１０ｍＬ置含适量肝素抗凝剂的无菌管中，用离心力１５００犵～２０００犵离心１５ｍｉｎ，取中间层进行真菌培养和涂片检查；另５ｍＬ分离血清进行血清学检查。６．２ 骨髓标本采集０．５ｍＬ～２ｍＬ抽吸标本置含肝素的灭菌容器中待检。６．３ 下呼吸道标本推荐每天一次连续三次痰标本送检和培养，或者收集支气管肺泡灌洗液检查。６．４ 肝、脾、淋巴结穿刺液进行直接涂片和培养。６．５ 皮肤及粘膜损害渗出物进行直接涂片和培养。６．６ 组织标本取肝、脾组织制成涂片或进行组织病理检查。６．７ 标识所采集的标本应进行标识，标识应具有唯一性。７ 实验室检验７．１ 检验程序检验程序参见附录Ｃ。７．２ 病原学检验直接涂片检查、分离培养、生化反应、动物接种方法参见附录Ｄ。７．３ 血清学检验双向免疫扩散试验、酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）参见附录Ｅ。８ 结果报告８．１ 直接涂片检查阳性，报告“涂片检查找到真菌孢子”，并注明细胞内或细胞外；直接涂片检查阴性，２犛犖／犜２６５７—２０１０报告“涂片检查未找到真菌孢子”。８．２ 分离培养阳性，且尿素酶试验阳性，明胶液化试验阴性，报告“检出荚膜组织胞浆菌”。８．３ 分离培养阳性，且尿素酶试验阴性，明胶液化试验阳性，报告“检出组织胞浆菌杜波变种”。８．４ 分离培养阴性，报告“培养八周末见菌落生长”。８．５ 双向免疫扩散试验、酶联免疫吸附试验阳性，报告“组织胞浆菌抗体呈阳性反应”，并注明检验方法；反之报告阴性，也注明检验方法。９ 阳性结果的处置对分离培养出的组织胞浆菌菌株应送上一级实验室做复检或鉴定。阳性结果应按规定向上级主管部门报告。３犛犖／犜２６５７—２０１０附 录 犃（资料性附录）实验室检验常用器材犃．１ 病原学检验常用器材犃．１．１ 霉菌培养箱（２５℃和３５℃）。犃．１．２ 显微镜。犃．１．３ 高压灭菌器。犃．１．４ 普通冰箱。犃．１．５ 离心机。犃．１．６ 生物安全柜。犃．１．７ 水浴锅。犃．１．８ 玻璃器皿、解剖用具、接种工具。犃．１．９ 动物饲养器具等。犃．２ 血清学检验常用器材犃．２．１ 酶联免疫测定仪。犃．２．２ 洗板机。犃．２．３ 电热恒温箱。犃．２．４ 普通冰箱。犃．２．５ 普通离心机。犃．２．６ ９６孔聚乙烯反应板。犃．２．７ 微量加样器。犃．２．８ 振荡器。犃．２．９ 玻片、打孔器。４犛犖／犜２６５７—２０１０附 录 犅（资料性附录）常用培养基及试剂犅．１ 病原学检验常用培养基及试剂犅．１．１ 沙氏琼脂培养基（犛犇犃）犅．１．１．１ 组成葡萄糖 ４０．０ｇ蛋白胨 １０．０ｇ琼脂 １５．０ｇ蒸馏水 １０００ｍＬ犅．１．１．２ 制法上述混合后１２１℃１０ｍｉｎ灭菌，冷却至５０℃左右加入庆大霉素５０ｍｇ、放线菌酮２００ｍｇ，混匀，分装试管（１８ｍｍ×１８０ｍｍ）每管加培养基７ｍＬ，置斜面，冷后备用。犅．１．２ 脑心浸汁培养基（犅犎犾）犅．１．２．１ 组成脑心浸膏 ３５．０ｇ琼脂 １５．０ｇ蒸馏水 １０００ｍＬ犅．１．２．２ 制法上述混合后，１２１℃１０ｍｉｎ灭菌后冷却至５０℃左右，分装试管（１８ｍｍ×１８０ｍｍ）每管加培养基７ｍＬ，置斜面，冷后备用。不加琼脂为液体培养基。犅．１．３ 尿素琼脂犅．１．３．１ 组成葡萄糖 ４０．０ｇ琼脂 ２０．０ｇ蛋白胨 １．０ｇ氯化钠 １５．０ｇ磷酸二氢钾 ４２．０ｇ酚红 ０．０１２ｇ２０％尿素（后加）蒸馏水 １０００ｍＬ犅．１．３．２ 制法各成分混合均匀后调ｐＨ至６．８，加入琼脂２０．０ｇ，１２１℃１０ｍｉｎ灭菌，冷却至４５℃～５０℃时，每５犛犖／犜２６５７—２０１０４５０ｍＬ培养基中加入抽滤灭菌的２０％尿素５０ｍＬ，均匀后分装试管（１２ｍｍ×１００ｍｍ）每管３ｍＬ置斜面，冷后备用。犅．１．４ 明胶培养基犅．１．４．１ 组成明胶 １２．０ｇ肉浸液 １００ｍＬ犅．１．４．２ 制法１００ｍＬ肉浸液中加入明胶１２．０ｇ，隔水加热溶解，矫正ｐＨ至７．２，趁热以绒布过滤。分装小试管（１２ｍｍ×１００ｍｍ）每管３ｍＬ，１２１℃１５ｍｉｎ灭菌后置斜面，冷后备用。犅．１．５ 瑞氏染液犅．１．５．１ 组成缓冲液：磷酸钾 １．６３ｇ磷酸氢二钠 ３．２０ｇ蒸馏水 １０００ｍＬｐＨ７．０染液：瑞氏染色粉 ０．３ｇ中性甘油 ３．０ｍＬ甲醇 ９７．０ｍＬ犅．１．５．２ 制法在研钵中研磨粉，加甘油，再研磨，加甲醇，充分混合，倒密闭瓶中，用前过滤。犅．１．６ 吉姆萨染液犅．１．６．１ 组成缓冲液：磷酸钾 ２．５９ｇ磷酸氢二钠 ６．７ｇ蒸馏水 １０００ｍＬｐＨ７．０染液：吉姆萨粉 ０．６ｇ中性甘油 ５０ｍＬ甲醇 ５０ｍＬ犅．１．６．２ 制法在研钵中研磨粉，加甘油，再研磨，加甲醇，充分混合，倒密闭瓶中。犅．１．６．３ 最终染液缓冲液６ｍＬ加染液２ｍＬ充分混匀。６犛犖／犜２６５７—２０１０犅．２ 血清学检验常用试剂犅．２．１ 双向免疫扩散试验试剂犅．２．１．１ 狆犎８．６，０．１犿狅犾／犔巴比妥巴比妥钠缓冲液巴比妥 １．８４ｇ巴比妥钠 １０．３ｇ硫柳汞 １００ｍｇ蒸馏水 至５００ｍＬ，加热溶解。犅．２．１．２ ２１０犵／犔琼脂称取琼脂糖１０ｇ置１０００ｍＬ三角烧瓶中，加蒸水５００ｍＬ，水浴煮沸溶解后调整ｐＨ８．６，０．１ｍｏｌ／Ｌ巴比妥巴比妥钠缓冲液５００ｍＬ，加０．１ｇ叠氮钠防腐，混匀后分装置４℃冰箱保存备用。犅．２．１．３ 组织胞浆菌诊断抗原液由有资质的机构提供，选择适宜的稀释度。犅．２．２ 酶联免疫吸附试验（犈犔犐犛犃）试剂犅．２．２．１ 包被稀释液（０．０５ｍｏｌ／Ｌ碳酸钠碳酸氢钠缓冲液，ｐＨ９．６）：碳酸钠 １．５ｇ碳酸氢钠 ２．９ｇ叠氮钠 ０．２ｇ双蒸水 １０００ｍＬ，调ｐＨ９．６。犅．２．２．２ 封闭液（５％小牛血清／ＰＢＳ溶液）：小牛血清 ５０ｍＬＰＢＳ（ｐＨ７．４） ９５０ｍＬ。犅．２．２．３ 洗涤液（ＰＢＳＴ，ｐＨ７．４）：氯化钠 ８．０ｇ磷酸二氢钾 ０．２ｇ十二水磷酸氢二钠 ２．９ｇ氯化钾 ０．２ｇ硫柳汞 ０．１ｇ吐温２０ ０．５ｍＬ双蒸水 １０００ｍＬ，调ｐＨ７．４。犅．２．２．４ 样本稀释液（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）：氯化钠 ８．０ｇ磷酸二氢钾 ０．２ｇ十二水磷酸氢二钠 ２．９ｇ氯化钾 ０．２ｇ硫柳汞 ０．１ｇ双蒸水 １０００ｍＬ，调ｐＨ７．４。犅．２．２．５ 酶标记第二抗体、阴阳性对照血清：由有资质的机构提供。７犛犖／犜２６５７—２０１０犅．２．２．６ 底物液（ＴＭＢ过氧化氢尿素溶液）：底物液Ａ（３、３′、５、５′四甲基联苯胺，ＴＭＢ）：ＴＭＢ ２００ｍｇ无水乙醇 １００ｍＬ双蒸水 至１０００ｍＬ。底物液Ｂ缓冲液（０．１ｍｏｌ／Ｌ柠檬酸０．２ｍｏｌ／Ｌ磷酸氢二钠缓冲液，ｐＨ５．０～５．４）：磷酸氢二钠 １４．６０ｇ柠檬酸 ９．３３ｇ０．７５％过氧化氢尿素 ６．４ｍＬ三蒸水 １０００ｍＬ，调ｐＨ５．０～５．４将底物液Ａ和底物液Ｂ按１∶１混合即成ＴＭＢ过氧化氢尿素应用液。犅．２．２．７ 终止液（２ｍｏｌ／Ｌ硫酸溶液）：双蒸水６００ｍＬ，浓硫酸１００ｍＬ（缓慢滴加并不断搅拌），加双蒸水至９００ｍＬ。８犛犖／犜２６５７—２０１０附 录 犆（资料性附录）组织胞浆菌检验程序图犆．１ 组织胞浆菌检验程序９犛犖／犜２６５７—２０１０附 录 犇（资料性附录）病原学检查犇．１ 直接涂片检查犇．１．１ 瑞氏染色犇．１．１．１ 将涂片平放染色架上。犇．１．１．２ 加瑞氏染液数滴，以覆盖涂片为宜约１ｍｉｎ。犇．１．１．３ 滴加约等量的缓冲液与染液混合，室温下染色５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ。犇．１．１．４ 用流水冲去染液，干燥后油镜检查。犇．１．２ 吉姆萨染色犇．１．２．１ 把涂片浸入１００％甲醇３ｍｉｎ～５ｍｉｎ。犇．１．２．２ 用混合好的吉姆萨染液覆盖玻片，放置１５ｍｉｎ。犇．１．２．３ 用流水冲去染液，待干燥后油镜检查。犇．１．３ 结果犇．１．３．１ 油镜下检查，荚膜组织胞浆菌表现为２μｍ～４μｍ直径、大小一致的圆形或卵圆形、芽生、有荚膜孢子，一端较尖，一端较圆，周围有一个似荚膜的亮圈，通常在大单核或多形核细胞内，有时在组织细胞外，多聚集成群，应怀疑组织胞浆菌。犇．１．３．２ 组织胞浆菌杜波变种为１２μｍ～１５μｍ大小的、厚壁、圆形、芽生孢子，细胞内可见脂肪小滴，少数可见基底出芽。犇．１．３．３ 找到符合以上形态特征的真菌孢子为直接涂片检查阳性；反之，为直