搜索
书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２４９７．３—２０１０进出口危险化学品安全试验方法第３部分：大型溞繁殖试验犜犲狊狋犿犲狋犺狅犱狅犳犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋犱犪狀犵犲狉狅狌狊犮犺犲犿犻犮犪犾狊—犘犪狉狋３：犇犪狆犺狀犻犪犿犪犵狀犪狉犲狆狉狅犱狌犮狋犻狅狀狋犲狊狋２０１００３０２发布２０１００９１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 ＳＮ／Ｔ２４９７《进出口危险化学品安全试验方法》系列标准共分为２９部分：———第１部分：体内哺乳动物肝细胞程序外ＤＮＡ合成（ＵＤＳ）试验；———第２部分：空斑形成细胞（ＰＦＣ）试验；———第３部分：大型溞繁殖试验；———第４部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验；———第５部分：睾丸细胞ＵＤＳ试验；———第６部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验；———第７部分：小鼠耳肿胀试验；———第８部分：腘窝淋巴结试验；———第９部分：血清溶血素测定试验；———第１０部分：Ｔ淋巴细胞增殖功能测定试验；———第１１部分：种系突变试验；———第１２部分：单细胞凝胶电泳分析试验；———第１３部分：荧光原位杂交试验；———第１４部分：ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳试验；———第１５部分：ＰＣＲＳＳＣＰ实验；———第１６部分：ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ实验；———第１７部分：哺乳动物行为毒理学试验；———第１８部分：ＤＮＡ加合物的检测方法；———第１９部分：ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ实验；———第２０部分：Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定蛋白质含量；———第２１部分：琼脂糖凝胶电泳试验；———第２２部分：ＤＮＡ的Ｔｍ值测定方法；———第２３部分：细胞器的分离实验方法；———第２４部分：细胞免疫功能体外检测方法；———第２５部分：体液免疫功能试验；———第２６部分：巨噬细胞功能试验；———第２７部分：流式细胞术检测凋亡；———第２８部分：穿梭质粒在突变检验中的应用；———第２９部分：生化需氧量（ＢＯＤ）测定。本部分为ＳＮ／Ｔ２４９７的第３部分。本部分修改采用经济合作与发展组织（ＯＥＣＤ）化学品测试指南ＮＯ．２１１（２００８）《大型溞繁殖试验》（英文版），其有关技术内容与上述方法完全一致，在标准文本格式上按ＧＢ／Ｔ１．１—２０００做了编辑性修改。本部分的附录Ａ为规范性附录，附录Ｂ、附录Ｃ、附录Ｄ、附录Ｅ、附录Ｆ为资料性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分负责起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国湖南出入境检验检疫局。本部分主要起草人：贾晓川、王利兵、陈练、李宁涛、张园、张颖。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２４９７．３—２０１０进出口危险化学品安全试验方法第３部分：大型溞繁殖试验１ 范围ＳＮ／Ｔ２４９７的本部分规定了进出口危险化学品大型溞繁殖试验的试验设备、试验程序、试验质量控制和试验结果。本部分适用于进出口危险化学品对水生生物的毒性的测定。２ 术语和定义下列术语和定义适用于本部分。２．１ 亲溞 狆犪狉犲狀狋犪狀犻犿犪犾狊试验开始时用于繁殖的雌溞。２．２ 幼溞 狅犳犳狊狆狉犻狀犵试验期间亲溞所产的小溞。２．３ 内禀增长率 犻狀狋狉犻狀狊犻犮狉犪狋犲狅犳犻狀犮狉犲犪狊犲综合繁殖量与特定种龄死亡率而测定种群增长能力的参数。稳定状态的种群，内禀增长率为零。增长的种群，内禀增长率为正；衰退的种群，内禀增长率为负。２．４ 效应浓度 犈犆狓引起受试生物繁殖量降低ｘ％时的受试物浓度。２．５ 最低可观察效应浓度 犾狅狑犲狊狋狅犫狊犲狉狏犲犱犲犳犳犲犮狋犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀，犔犗犈犆与对照相比，对受试生物产生显著（犘＜０．０５）效应的最低受试物浓度。２．６ 无可观察效应浓度 狀狅狅犫狊犲狉狏犲犱犲犳犳犲犮狋犮狅狀犮犲狀狋狉犪狋犻狅狀，犖犗犈犆试验中直接低于ＬＯＥＣ的受试物设置浓度，即与对照相比，对受试生物未产生显著（犘＜０．０５）效应的最高受试物设置浓度。２．７ 死亡 犿狅狉狋犪犾犻狋狔溞体不动，即不能游动，或轻晃试验容器，１５ｓ内，没有观察到附肢或后腹部活动。３ 试验原理在大型溞繁殖期间，测定受试物对大型溞死亡率和繁殖的影响。大型溞在含有不同浓度的受试物溶液中暴露周期为２１ｄ，通过对暴露于受试物中的亲溞繁殖量与对照比较，确定最低可观察效应浓度（ＬＯＥＣ）和无可观察效应浓度（ＮＯＥＣ），以及导致大型溞繁殖量降低ｘ％的效应浓度等。１犛犖／犜２４９７．３—２０１０４ 试验仪器４．１ 试验容器和其他与试验液接触的器皿应为全玻璃制品，或由其他化学惰性材料制成。试验容器通常为玻璃烧杯。４．２ 需用下列部分或全部试验仪器：ａ） 溶氧仪；ｂ）温度控制仪；ｃ）ｐＨ计；ｄ）测定水硬度的仪器；ｅ）测定水中总有机碳（ＴＯＣ）或化学需氧量（ＣＯＤ）的仪器；ｆ）控制光照周期与测定光密度的仪器。５ 试验程序５．１ 受试生物所用物种为大型溞（犇犪狆犺狀犻犪犿犪犵狀犪）：ａ） 无性繁殖系最好用基因型进行鉴定，要求亲溞所产幼溞的平均值≥６０只；ｂ）试验开始时，溞龄应不超过２４ｈ，且应不使用第一批子代；ｃ）试验用溞应来自同一健康的储备群体，应无以下反常现象如高死亡率、出现雄溞或冬卵、第一批幼溞产期延迟、体色异常等现象；ｄ）储备群体的培养条件（光照、温度、培养基、喂食、单位体积中的溞数）须与试验相近；ｅ）如果试验所用培养基与常规培养所用的不同，正确操作步骤应包括一个为期３周（即一代）的供试前驯养期。５．２ 试验浓度与分组５．２．１ 试验浓度：ａ） 利用受试物的毒性资料，如急性试验和（或）预试验，选择试验浓度。ｂ）通常至少设置５个浓度，按几何级数排列，间距系数不超过３．２，每一浓度应设置适当的平行组。若试验浓度个数小于５，应给予合理的解释。试验浓度最高不超过受试物在试验液中的溶解度。ｃ）在浓度设置时，须牢记：———如果旨在获得ＬＯＥＣ／ＮＯＥＣ，试验最低浓度组繁殖量不能明显低于对照；最高浓度组繁殖量应明显低于对照。否则应降低最低浓度或增加最高浓度重新试验。———如果要估计影响繁殖的ＥＣｘ，建议用足够的浓度组来确定ＥＣｘ及其恰当的置信限。如果估算影响繁殖的ＥＣ５０，最高试验浓度应大于ＥＣ５０。———对成龄溞的存活率在统计上有显著影响的浓度不能包括在试验浓度范围内。———如果使用助溶剂或分散剂配制试验液，其在试验容器中浓度不能大于０．１ｍＬ／Ｌ，并在所有试验容器中应一致。５．２．２ 对照：ａ） 应设置试验培养基对照，若使用助溶剂或分散剂应设置助溶剂或分散剂的对照。所用助溶剂或分散剂的浓度应与含有受试物的容器中的一致。所用平行数量应合适。ｂ）试验中，对照组每只亲溞所产成活幼溞的平均数的变异系数应≤２５％，应按试验设计中分别培养的溞进行记录。５．３ 试验准备５．３．１ 试验用水：２犛犖／犜２４９７．３—２０１０ａ） 试验中应使用规定的培养基，如ＥｌｅｎｄｔＭ４和Ｍ７培养基（见附录Ａ）。ｂ）如果培养基中含有未规定的添加剂，应明确注明，并在试验报告中给出相应资料，特别是碳含量。应测定含有有机附加物的贮备液中总有机碳（ＴＯＣ）和（或）化学需氧量（ＣＯＤ），供估算试验培养基中所提供的ＴＯＣ／ＣＯＤ量。建议加入藻之前的培养基中的ＴＯＣ＜２ｍｇ／Ｌ。ｃ）当受试物含有金属时，建议不使用Ｍ４和Ｍ７培养基。同时避免采用其他含有螯合剂的培养基。可采用替代的培养基，如加有海藻提取物的ＡＳＴＭ新鲜重组水。ｄ）试验开始与试验期间，溶解氧浓度应大于３ｍｇ／Ｌ。ｐＨ值应在６～９的范围内。正常情况下，任一试验中ｐＨ值的变化不应大于１．５个单位。推荐硬度（以ＣａＣＯ３计）在１４０ｍｇ／Ｌ以上。５．３．２ 试验液：ａ） 选定浓度的试验液通常用稀释贮备液的方法配制。推荐将受试物溶解到试验培养基中配制贮备液。ｂ）在一些情况下为了配制一个合适浓度的贮备液，允许但应尽量避免使用有机溶剂或分散剂。可用的有机溶剂有丙酮、乙醇、甲醇、二甲基甲酰胺和三甘醇。可用的分散剂有聚氧乙烯化脂肪酸甘油酯、０．０１％的甲基纤维素甲醚和聚氧乙烯化氢化蓖麻油。试验液中的受试物应不超出其溶解度。５．４ 试验步骤５．４．１ 试验条件试验条件如下：ａ） 试验周期试验周期为２１ｄ。ｂ）负荷———亲溞应分开培养，每个容器一只，容器中培养基体积为５０ｍＬ～１００ｍＬ；———基于满足测定受试物浓度的化学分析的要求，允许增加培养基体积；若所用体积大于１００ｍＬ，应增加溞的喂食量以确保有足够的食物；———对于流水式试验，考虑技术原因，可变动设计如分成４个平行，每组１０只在一个较大的试验容器中，应记录对于试验设计的任何变化。ｃ）试验生物———对于半静态试验，要求每一浓度用４０只溞，分成４个平行，每组１０只，每一试验浓度组与对照组最低不应少于１０只动物，并分别培养；———对于流水式试验，要求每一浓度用４０只溞，分成４个平行，每组１０只。可以使用数量更少的溞进行试验，但至少２０只，且应该以相同数量分成２个或多个平行（如４个平行每组５只）；———动物按组培养的试验，如果有亲溞死亡，则不能以试验结束时每只存活亲溞所产存活幼溞总数表示繁殖量，应以试验开始时存在的每只亲溞所产存活幼溞总数表示；———试验生物的分配及随后所有操作应按随机方式处理。若试验结果可能受到初始条件或环境条件的影响，应进行空白对照试验。ｄ）喂食———对于半静态试验，推荐每天喂食，或至少每周三次（与培养基对照进行变化）。由此（如流水式试验）引起的偏差应予记录。———试验期间亲溞的食物可用：小球藻（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｓｐ．）、羊角月芽藻（Ｓｅｌｅｎａｓｔｒｕｍｃａｐｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）和栅藻（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｕｍｓｓｕｂｓｐｉｃａｔｕｓ），喂食量应以提供给每只亲溞有机碳数量为基础。整个试验过程食物量应在推荐的范围内，即每只溞０．１ｍｇ／ｄ～０．２ｍｇ／ｄ。推荐范围内的食物量可以在测试期间平均供给，如有特殊要求也可以逐渐增量供给。３犛犖／犜２４９７．３—２０１０———如果用替代测定法（如藻细胞数量或吸光度）测定喂食量，每个实验室必须作出自己的替代测量指标与藻培养物的碳含量关系的线性图（参见附录Ｂ）。线性图每年应至少校验一次，如果培养条件发生改变，校验应更频繁。与细胞计数相比，光吸收法是一种较好的测定碳含量的替代方法。———大型溞应喂食浓缩了的藻液，应避免过多的藻培养液进入试验容器，浓缩藻液可通过离心获得，用蒸馏水、去离子水或溞培养基使其重新悬浮。ｅ）光照光照１６ｈ，光强不超过１５μＥ／（ｍ２·ｓ）～２０μＥ／（ｍ２·ｓ）。ｆ）温度试验液的温度在１８℃～２２℃范围内。对于同一试验，应尽可能使温度变化不超过２℃（如１８℃～２０℃、１９℃～２１℃、２０℃～２２℃）。最好另加一个试验容器，以监测实际水温。ｇ）曝气试验期间无需曝气。ｈ）试验培养基更换———培养基的更换频率取决于受试物的稳定性，但每周至少应更换三次；———如果在为期最多３ｄ的稳定性预试验中受试物浓度不稳定，即在设定值的８０％～１２０％范围外或下降到初始浓度测定值的８０％以下，应考虑增加更换频率或使用流水式试验；———半静态试验中更换培养基时，应另准备一套试验系列，同时用口径合适的玻璃吸管转移亲溞。转移溞时应尽量减少所吸的培养基的体积。５．４．２ 观察试验期间的观察结果应记录在数据表（参见附录Ｃ和附录Ｄ）上。若需测定其他项目，如亲溞存活率、初次繁殖时间、内禀增长率、亲溞体长、产溞批数与每批数量、死胎数、雄溞或冬卵的出现等，需进行其他方面的观察并记录。５．４．３ 幼溞从第一批幼溞出现开始，应每天移出和记数每只亲溞所产幼溞，以避免消耗食物影响亲溞。统计存活幼溞数量，但出现死胎或死溞也应记录。５．４．４ 死亡率应每天记录亲溞死亡数，至少与幼溞记录次数相同。５．４．５ 其他参数试验结束时测量亲溞体长（即身体长度，不含肛刺）、亲溞第一批产溞时间（及其余产溞时间）、产溞批数与每批数量、死胎数量、雄溞（雌雄判定参见附录Ｅ）或冬卵的出现、种群体内禀增长率等。５．４．６ 分析、测定频率ａ） 新换培养基、原培养基、对照组与最高浓度组中氧浓度、温