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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２４９７．２２—２０１０进出口危险化学品安全试验方法第２２部分：犇犖犃的犜犿值测定方法犜犲狊狋犿犲狋犺狅犱狅犳犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋犱犪狀犵犲狉狅狌狊犮犺犲犿犻犮犪犾狊—犘犪狉狋２２：犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犇犖犃犜犿２０１００３０２发布２０１００９１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 ＳＮ／Ｔ２４９７《进出口危险化学品安全试验方法》系列标准共分为２９部分：———第１部分：体内哺乳动物肝细胞程序外ＤＮＡ合成（ＵＤＳ）试验；———第２部分：空斑形成细胞（ＰＦＣ）试验；———第３部分：大型溞繁殖试验；———第４部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验；———第５部分：睾丸细胞ＵＤＳ试验；———第６部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验；———第７部分：小鼠耳肿胀试验；———第８部分：胭窝淋巴结试验；———第９部分：血清溶血素测定试验；———第１０部分：Ｔ淋巴细胞增殖功能测定试验；———第１１部分：种系突变试验；———第１２部分：单细胞凝胶电泳分析试验；———第１３部分：荧光原位杂交试验；———第１４部分：ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳试验；———第１５部分：ＰＣＲＳＳＣＰ实验；———第１６部分：ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ实验；———第１７部分：哺乳动物行为毒理学试验；———第１８部分：ＤＮＡ加合物的检测方法；———第１９部分：ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ实验；———第２０部分：Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定蛋白质含量；———笫２１部分：琼脂糖凝胶电泳试验；———第２２部分：ＤＮＡ的Ｔｍ值测定方法；———第２３部分：细胞器的分离实验方法；———第２４部分：细胞免疫功能体外检测方法；———第２５部分：体液免疫功能试验；———第２６部分：巨噬细胞功能试验；———第２７部分：流式细胞术检测凋亡；———第２８部分：穿梭质粒在突变检验中的应用；———第２９部分：生化需氧量（ＢＯＤ）测定。本部分为ＳＮ／Ｔ２４９７系列标准的第２２部分。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分负责起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国湖南出入境检验检疫局。本部分主要起草人：贾晓川、王利兵、吕刚、李晶、李学洋、陈春。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２４９７．２２—２０１０进出口危险化学品安全试验方法第２２部分：犇犖犃的犜犿值测定方法１ 范围ＳＮ／Ｔ２４９７的本部分规定了进出口危险化学品安全试验中ＤＮＡ的Ｔｍ值测定试验的试验样品、溶液、试验步骤和试验结果。本部分适用于进出口危险化学品安全试验中ＤＮＡ的Ｔｍ值测定。２ 原理ＤＮＡ在当温度升到一定的数值时，两条核苷酸单链之间的氢键开始逐渐被打开（ＤＮＡ开始变性）分离，从而使ＤＮＡ溶液在紫外波长为２６０ｎｍ处吸收明显增加；当温度高达一定值时，ＤＮＡ完全分离成单链，此后继续升温，ＤＮＡ溶液的紫外吸收也不再增加。ＤＮＡ热变性时，紫外吸收增加达到最大值一半时所对应的温度称为该ＤＮＡ的热变性温度或熔解温度，即Ｔｍ值。３ 试剂３．１ 水本标准所述试验方法中涉及到的水均为灭菌蒸馏水。３．２ 氯化钠柠檬酸三钠缓冲溶液（犛犛犆）取一定量的氯化钠和柠檬酸三钠用水溶解，使得溶液中氯化钠浓度为０．１５Ｍ，柠檬酸三钠浓度为０．０１５Ｍ。４ 试验步骤４．１ 犇犖犃浓度用紫外分光光度计，在２６０ｎｍ处测定ＤＮＡ样品吸光度值犃，犃×５０μｇ／ｍＬ，计算得出ＤＮＡ浓度。４．２ 样品的配制取ＤＮＡ样品６０μｇ，用ＳＳＣ稀释至３ｍＬ（吸光度０．３～０．４）。４．３ 样品纯度用紫外分光光度计，以ＳＳＣ为参比溶液，分别测定样品２５℃时２６０ｎｍ、２８０ｎｍ和２３０ｎｍ处的吸光度值犃，当１．７５＜犃２６０犃２８０＜１．８５且０．５＜犃２３０犃２６０＜０．６时，表明样品纯度达到测定要求，可以进行Ｔｍ值测定。４．４ 测定用带有程序升温装置的紫外分光光度计，以ＳＳＣ为参比溶液，测定样品由２５℃～９９℃的吸光度犃（７５℃以后每升高１℃，记录一次吸光度值；一般２５℃～７５℃，吸光度变化不大；９４℃以后吸光度不再变化）。５ 试验结果以记录的温度和相应的吸光度绘制ＤＮＡ热变性曲线（精确测量时须将吸光度乘以相对膨胀体积犞Ｔ／犞２５，校正为２５℃水溶液体积的吸光度），热变性曲线的中点对应的温度为Ｔｍ值。１犛犖／犜２４９７．２２—２０１０书书书０１０２—２２７９４２犜／犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准进出口危险化学品安全试验方法第２２部分：犇犖犃的犜犿值测定方法ＳＮ／Ｔ２４９７．２２—２０１０中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６ ６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６ 印张０．５ 字数４千字２０１０年６月第一版 ２０１０年６月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２０９５５ 定价１４．００元