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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２４６４—２０１０洋葱条黑粉病菌检疫鉴定方法犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犝狉狅犮狔狊狋犻狊犮犲狆狌犾犪犲犉狉狅狊狋２０１００１１０发布２０１００７１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布食品伙伴网书书书中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准洋葱条黑粉病菌检疫鉴定方法ＳＮ／Ｔ２４６４—２０１０中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６ ６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６ 印张０．５ 字数８千字２０１０年４月第一版 ２０１０年４月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２０７０４ 定价１４．００元食品伙伴网书书书前 言本标准的附录Ａ和附录Ｂ均为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本标准主要起草人：廖芳、罗加凤、郭京泽、张裕君、刘跃庭、崔铁军、王金成、刘鹏。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２４６４—２０１０食品伙伴网洋葱条黑粉病菌检疫鉴定方法１ 范围本标准规定了进出境植物检疫中洋葱条黑粉病菌（Ｕｒｏｃｙｓｔｉｓｃｅｐｕｌａｅ）的检疫鉴定方法。本标准适用于葱属寄主上洋葱条黑粉病菌的检疫鉴定。２ 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＧＢ／Ｔ１８０８５ 植物检疫 小麦矮化腥黑穗病菌检疫鉴定方法３ 原理洋葱条黑粉病菌（ＵｒｏｃｙｓｔｉｓｃｅｐｕｌａｅＦｒｏｓｔ）主要为害葱属（Ａｌｌｉｕｍｓｐｐ．）植物，不危害葱属以外的植物。洋葱条黑粉病菌寄主范围、孢子球形态特征、寄主植物的症状（参见附录Ａ）、洋葱琼脂培养基上孢子球萌发特性是鉴定该病菌的依据。４ 仪器和用具多功能显微镜（具测微尺）、体视显微镜、手持放大镜、低速离心机、往复式振荡器、涡旋振荡器、干热灭菌器、高压灭菌器、普通天平（感量１／１００ｇ）、生物安全柜或超净台、生物培养箱（具光照）、可调微量加样器（５μＬ～２００μＬ）、三角瓶（２５０ｍＬ）、离心管、载玻片（长×宽为２５．３ｍｍ×７６．２ｍｍ，厚０．８ｍｍ）、盖玻片（１８ｍｍ×１８ｍｍ）、Ｐａｒａｆｉｌｍ膜或铝箔纸、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管（１．５ｍＬ）、培养皿、接种针、三角推。５ 试剂和培养基５．１ 试剂有效成分为０．２５％的次氯酸钠溶液、吐温２０（Ｔｗｅｅｎ２０）、席尔氏浮载剂（见ＧＢ／Ｔ１８０８５—２０００附录Ａ中席尔氏浮载剂配制方法）、封片剂、无荧光显微镜物镜镜头油（Ｎｄ＝１．５１６）、琼脂粉、灭菌水。５．２ 培养基洋葱琼脂培养基用于病原菌培养性状的观察及病原菌的保存。洋葱琼脂培养基的制备：称取琼脂粉１５ｇ～２０ｇ，加入９００ｍＬ水和１００ｍＬ新鲜的健康洋葱汁液，装入三角瓶中，１２１℃高压灭菌３０ｍｉｎ，待冷却至４０℃左右，倒入培养皿，凝固后，用三角推蘸取悬浮液均匀涂布在培养基表面。６ 实验室检验６．１ 种子的洗涤检验６．１．１ 样品制备及离心与定容按ＧＢ／Ｔ１８０８５执行。６．１．２ 镜检按ＧＢ／Ｔ１８０８５检查洋葱条黑粉病菌孢子球的有无及其形态大小，经检查含有可疑孢子球的进一步作萌发实验。１犛犖／犜２４６４—２０１０食品伙伴网６．２ 鳞茎与寄主残体的检验用放大镜或肉眼仔细检查鳞茎或寄主残体表面是否存在银灰色泡状囊肿，用针刺破银灰色泡状囊肿，用席尔氏浮载剂制成玻片，在显微镜下观察孢子球的形态大小，并将可疑孢子球进一步作萌发实验。６．３ 孢子球的萌发试验在Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ离心管中加入适量次氯酸钠溶液，挑取一定数量的孢子球放入，密度以显微镜低倍视野下４０个～６０个孢子球为宜，用涡旋振荡器混合，消毒５ｍｉｎ后，以３０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ，立即用微量加样器吸去上清液，加无菌水离心清洗２次，将孢子球沉淀物转至洋葱琼脂培养基上培养，在２０℃、１２ｈ光照、７５％的相对湿度条件下生物培养箱中培养，重复３个培养皿。７ 鉴定特征７．１ 鳞茎与寄主残体的症状种子发芽后２周内，病菌从子叶基部等处侵入，病苗叶色微黄，局部膨肿扭曲，银灰色纵向排列的不透明的泡状瘤肿出现在子叶和叶片上，随后破裂露出黑褐色的孢子团，成株期的叶、叶鞘和鳞片出现银灰色瘤肿条斑，病部充满黑粉，重病株矮化或死亡。７．２ 孢子球形态特征洋葱条黑粉病菌的孢子球由许多细胞组成，孢子球直径１５μｍ～２０μｍ，多为８个孢子球聚在一起。孢子球中央有暗色，大小在１１μｍ～１５μｍ的冬孢子常为１个，甚少２个，成熟孢子球的冬孢子外形为不规则的多面体，壁褐色，厚约１μｍ，外面紧密包围着无色至淡黄色、透明的不孕孢，不孕孢没有原生质，胞壁相对较薄，１２个～１５个不孕孢甚至２０个，４μｍ～８μｍ，外形和大小一致（参见附录Ｂ）。７．３ 孢子球萌发特性孢子球在洋葱琼脂培养基上培养３ｄ后进行观察，冬孢子伸出１条甚少２条短而半圆形、无色的先菌丝，先菌丝长至４０μｍ～５０μｍ停止生长，萌发过程中不产生担孢子和菌丝连接，但先菌丝能产生分支，分支菌丝再形成分隔的菌丝，分支菌丝长至１５μｍ左右停止生长，这种分支菌丝能够断裂，再形成新的菌丝体，菌丝上直接形成孢子球，将萌发后的菌丝转接到琼脂斜面上保存。８ 结果判定如果鳞茎及寄主残体上具有７．１的特征，且孢子球特征及其萌发特性与７．２、７．３相符，判定为洋葱条黑粉病菌。９ 实验结果和样品保存经鉴定为洋葱条黑粉病菌的样品置低温干燥处妥善保存６个月，以备接受复核、重复鉴定。保存期满后，需经灭菌处理。２犛犖／犜２４６４—２０１０食品伙伴网附 录 犃（资料性附录）洋葱条黑粉病菌的背景资料犃．１ 分类地位英文名：ｏｎｉｏｎｓｍｕｔ中文名：洋葱条黑粉病菌学名：ＵｒｏｃｙｓｔｉｓｃｅｐｕｌａｅＦｒｏｓｔ洋葱条黑粉病菌（ＵｒｏｃｙｓｔｉｓｃｅｐｕｌａｅＦｒｏｓｔ）属真菌界（Ｆｕｎｇｉ），担子菌门（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ），黑粉菌纲（Ｕｓｔｉｌａｇｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ），黑粉菌目（Ｕｓｔｉｌａｇｉｎａｌｅｓ），条黑粉菌属（Ｕｒｏｃｙｓｔｉｓ）。犃．２ 分布非洲：埃及、加蓬、摩洛哥。亚洲：印度、伊朗、伊拉克、日本、韩国、尼泊尔、菲律宾、泰国、中国。大洋洲及太平洋岛屿：澳大利亚、新西兰。欧洲：奥地利、比利时、北爱尔兰自治区、保加利亚、捷克、斯洛伐克、丹麦、芬兰、法国、德国、希腊、意大利、马耳他、荷兰、挪威、波兰、罗马尼亚、瑞典、瑞士、前苏联、前南斯拉夫、塞浦路斯、匈牙利。北美洲：加拿大、墨西哥、美国。中美洲及西印度群岛：古巴、波多黎各、圣卢西亚。南美洲：智利、秘鲁。犃．３ 寄主洋葱ＡｌｌｉｕｍｃｅｐａＬ．、韭葱Ａ．ｐｏｒｒｕｍＬ．、大蒜Ａ．ｓａｔｉｖｕｍＬ．、鸦葱Ａ．ｖｉｎｅａｌｅＬ．、Ａ．ｎｅｖａｄｅｎｓｅＬ．、大葱Ａ．ｆｉｓｔｕｌｏｓｕｍＬ．、长喙葱Ａ．ｇｌｏｂｏｓｕｍＲｅｄ．、韭菜Ａ．ｏｄｏｒｕｍＬ．等葱属植物。犃．４ 危害及症状洋葱条黑粉病菌是洋葱的一种毁灭性病害，造成的损失达５０％～８０％。种子发芽后２周内，病菌从子叶基部等处侵入，病苗叶色微黄，局部膨肿扭曲，成株期的叶、叶鞘和鳞片受到感染时出现银灰色条斑，病部充满黑粉，重病株矮化或死亡。犃．５ 传播方式洋葱条黑粉病菌是一种土传病害，病菌的孢子球对干燥和寒冷的抵抗力较强，在干燥土壤中最长可存活２５年，是初次侵染源。土壤是一种主要的传播方式，也可以通过器具、风或者水流进行传播，另外带病的寄主组织和无性繁殖体也是传播此病的主要途径，种子一般不带病，但如混有病组织的碎片或病土，种子也是一种远距离传播的来源。犛犖／犜２４６４—２０１０食品伙伴网书书书犛犖／犜２４６４—２０１０附 录 犅（资料性附录）孢子球形态特征、萌发及分支菌丝的形成 １———孢子球；２———先菌丝；３———分支菌丝。图犅．１ 孢子球形态特征、萌发及分支菌丝的形成０１０２—４６４２犜／犖犛书号：１５５０６６·２２０７０４定价： １４．００元食品伙伴网