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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２３２１—２００９进出口食品中腈菌唑残留量检测方法气相色谱质谱法犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犿狔犮犾狅犫狌狋犪狀犻犾狉犲狊犻犱狌犲犻狀犳狅狅犱狊狋狌犳犳狊犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋—犌犆犕犛犿犲狋犺狅犱２００９０７０７发布２０１００１１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布食品伙伴网书书书前 言 本标准的附录Ａ为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国浙江出入境检验检疫局、中华人民共和国新疆出入境检验检疫局。本标准主要起草人：王金花、徐超一、卢晓宇、曾静、丁慧瑛、朱晓雨、李世雨、尚德军、韩深。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２３２１—２００９食品伙伴网进出口食品中腈菌唑残留量检测方法气相色谱质谱法１ 范围本标准中规定了食品中腈菌唑残留量的气相色谱质谱检测和确证方法。本标准适用于大米、小米、玉米、豆类、红茶、绿茶、花茶、乌龙茶、大麦茶、草莓、苹果、梨、小白菜、黄瓜、辣椒、胡萝卜、花生、榛子等植物源性产品；牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉、鱼肉、猪肝、羊肝、鸡肝、牛奶、蜂蜜等动物源性产品中腈菌唑残留量的检测和确证。２ 方法原理试样中残留的腈菌唑用乙腈或三氯甲烷提取，经过固相萃取（ＳＰＥ）柱或凝胶渗透色谱（ＧＰＣ）仪净化，用气相色谱质谱仪检测和确证，外标法定量。３ 试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为农残级，水为去离子水。３．１ 乙腈：色谱级。３．２ 甲苯。３．３ 丙酮。３．４ 正己烷。３．５ 乙酸乙酯。３．６ 环己烷。３．７ 三氯甲烷：色谱级。３．８ 甲醇：色谱级。３．９ 氯化钠：分析纯。３．１０ 无水硫酸钠：经６５０℃灼烧４ｈ，置于干燥器中备用。３．１１ 淋洗液：正己烷丙酮（４＋１，体积比）。取正己烷８０ｍＬ，加入２０ｍＬ丙酮，混匀。３．１２ 乙酸乙酯环己烷（１＋１，体积比）：取乙酸乙酯５０ｍＬ，加入５０ｍＬ环己烷，混匀。３．１３ 腈菌唑标准品（Ｍｙｃｌｏｂｕｔａｎｉｌ）：ＣＡＳ：８８６７１８９０，分子式：Ｃ１５Ｈ１７ＣｌＮ４，纯度≥９９％。３．１４ 腈菌唑标准储备溶液：准确称取适量的腈菌唑标准品（精确至０．１ｍｇ），用甲苯溶解，配制成１０００μｇ／ｍＬ的标准储备溶液，－１８℃下保存，有效期至少为１２个月。３．１５ 腈菌唑标准工作溶液：根据需要用甲苯稀释成适当浓度的标准工作溶液。０．１μｇ／ｍＬ的标准工作溶液在－１８℃下保存，有效期至少为６个月。３．１６ 石墨化碳固相萃取柱：ＥｎｖｉＣａｒｂ，６ｍＬ，５００ｍｇ，或相当者。３．１７ 滤膜：０．４５μｍ，有机相。４ 仪器和设备４．１ 粉碎机。４．２ 组织捣碎机。４．３ 超声波振荡器。１犛犖／犜２３２１—２００９食品伙伴网４．４ 萃取振荡器。４．５ 离心机。４．６ 固相萃取装置，带真空泵。４．７ 旋转蒸发仪。４．８ 旋涡混匀器。４．９ 自动快速浓缩仪（氮吹仪）。４．１０ 凝胶渗透色谱仪（ＧＰＣ）：配凝胶色谱柱。４．１１ 气相色谱质谱仪：配有电子轰击电离源（ＥＩ）。５ 试样制备与保存５．１ 粮谷、豆类、茶叶及坚果类取代表性样品５００ｇ，用粉碎机粉碎。混匀，均分成两份作为试样，分装入洁净的盛样袋内，密闭。除茶叶试样于４℃以下保存外，其他试样于－５℃保存。５．２ 水果或蔬菜类取代表性样品１０００ｇ，将其可食用部分（不可用水洗涤）切碎后，依次用捣碎机将样品加工成浆状。混匀，均分成两份作为试样，分装入洁净的盛样袋内，密闭。将试样于－１８℃以下冷冻保存。５．３ 肉及肉制品（畜、禽、水产品等）取代表性样品５００ｇ，将其切碎后，依次用捣碎机将样品加工成浆状，混匀，均分成两份作为试样，分装入洁净的盛样袋内，密闭。将试样于－１８℃以下冷冻保存。５．４ 牛奶取代表性样品约５００ｇ，混匀，均分成两份作为试样，分装入洁净的盛样瓶内，密闭。将试样于２℃～６℃条件下保存。５．５ 蜂产品取代表性样品约５００ｇ，未结晶的样品将其用力搅拌均匀，有结晶析出的样品可将样品瓶盖塞紧后，置于不超过６０℃的水浴中温热，等样品全部融化后搅匀，迅速冷却至室温。在融化时应注意防止水分挥发。装入洁净容器内，密闭，并标明标记。将试样于４℃下保存。注：在制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生腈菌唑残留含量的变化。６ 测定步骤６．１ 提取６．１．１ 针对粮谷、豆类、茶叶和坚果样品称取１０ｇ（精确至０．０１ｇ）试样于５０ｍＬ塑料离心管中，加１０ｍＬ水浸泡０．５ｈ。准确加入乙腈３０ｍＬ，以１００００ｒ／ｍｉｎ均质０．５ｍｉｎ（蜂蜜仅需涡旋混匀１ｍｉｎ），加入５ｇ氯化钠，摇匀，在３０℃以下超声提取２０ｍｉｎ，于４０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ。准确移取１５ｍＬ上层有机相至浓缩瓶中，在４０℃以下水浴减压浓缩至近干，待净化。６．１．２ 针对蔬菜、水果、肉类、动物肝脏样品称取１０ｇ（精确至０．０１ｇ）试样于５０ｍＬ塑料离心管中。准确加入乙腈３０ｍＬ，以下操作步骤同６．１．１。６．１．３ 针对蜂蜜样品称取１０ｇ（精确至０．０１ｇ）试样于５０ｍＬ塑料离心管中，加１０ｍＬ水混匀。准确加入乙腈３０ｍＬ，以下操作步骤同６．１．１。６．１．４ 针对牛奶样品称取１０ｇ（精确至０．０１ｇ）试样于５０ｍＬ塑料离心管中。依次加入５ｍＬ甲醇、约１０ｇ无水硫酸钠、２０ｍＬ三氯甲烷，混匀，振荡２０ｍｉｎ，经３０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，用移液器将下层三氯甲烷经无水硫酸２犛犖／犜２３２１—２００９食品伙伴网钠除水后移入浓缩瓶中，再用２０ｍＬ三氯甲烷重复上述过程。合并三氯甲烷提取液至浓缩瓶中，在４０℃以下水浴减压浓缩至近干，待净化。６．２ 净化６．２．１ 固相萃取净化６．２．１．１ 适用样品色素含量较高的样品，如蔬菜、水果与茶叶等。６．２．１．２ 净化步骤将石墨化碳固相萃取小柱安装在固相萃取柱的真空抽滤装置上，先用１０ｍＬ正己烷活化柱子，用２ｍＬ淋洗混合溶液（３．１１）溶解６．１残渣上柱，过完后再用２ｍＬ淋洗混合溶液反复清洗瓶子并过柱，然后用８ｍＬ淋洗混合溶液进行洗脱，整个固相萃取净化过程控制流速不超过６ｍＬ／ｍｉｎ。合并上样液及洗脱液约１２ｍＬ于试管中，４０℃氮气吹干。用甲苯定容至１ｍＬ，并过０．４５μｍ有机相滤膜，供气相色谱质谱仪测定和确证。６．２．２ 凝胶渗透色谱净化６．２．２．１ 适用样品脂肪含量较高的试样，如粮谷、豆类、坚果、肉类、肝脏、牛奶和蜂蜜等。６．２．２．２ 净化步骤用４ｍＬ乙酸乙酯环己烷混合溶液（３．１２）溶解６．１残渣，过ＧＰＣ净化，浓缩收集液至近干，用甲苯溶解并定容至１．０ｍＬ，过０．４５μｍ有机相滤膜，供气相色谱质谱仪测定和确证。６．２．２．３ 凝胶渗透色谱条件ａ） 凝胶色谱柱：ＳｈｏｄｅｘＣＬＮｐａｋＥＶＧ，２０．０×１００ｍｍ（预柱），ＳｈｏｄｅｘＣＬＮｐａｋＥＶ２０００，２０．０×３００ｍｍ或相当者；ｂ） 流动相：乙酸乙酯环己烷溶液（３．１２）；ｃ） 流动相流速：４ｍＬ／ｍｉｎ；ｄ） 检测波长：２５４ｎｍ；ｅ） 收集时间：１５ｍｉｎ～２０ｍｉｎ。６．３ 测定６．３．１ 气相色谱质谱条件ａ） 色谱柱：石英弹性毛细管柱ＤＢ５ｍｓ，３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ，或相当者；ｂ） 色谱柱温度：１００℃（１ｍｉｎ）→３０℃／ｍｉｎ→１３０℃→１５℃／ｍｉｎ→３００℃（３ｍｉｎ）；ｃ） 进样口温度：２９０℃；ｄ） 色谱质谱接口温度：２８０℃；ｅ） 载气：氦气，纯度≥９９．９９９％，流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ；ｆ） 进样量：２μＬ；ｇ） 进样方式：不分流进样；ｈ） 离子源：ＥＩ；ｉ） 电离能量：７０ｅＶ；ｊ） 离子源温度：２３０℃；ｋ） 四极杆温度：１５０℃；ｌ） 数据采集方式：选择离子监测方式（ＳＩＭ）；ｍ） 选择监测离子（ｍ／ｚ）：定量离子：１７９；定性离子（丰度比）：１５０（６４．４），２８８（１３．８），１８１（３５．５）；ｎ） 溶剂延迟时间：１０ｍｉｎ。注：以上所列参数是在ＡｇｉｌｅｎｔＧＣＭＳ６８９０Ｎ５９７５Ｂ仪器上完成的，列出试验用仪器型号仅是为了提供参考，并不涉及商业目的，鼓励标准使用者尝试采用不同厂家或型号的仪器。３犛犖／犜２３２１—２００９食品伙伴网６．３．２ 定量测定根据样液中腈菌唑含量的情况，选定浓度相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样液中腈菌唑响应值应在仪器检测的线性范围内。标准工作溶液和样液（６．２）等体积穿插进样测定。在上述色谱条件下，腈菌唑的保留时间约为１１．８ｍｉｎ，标准品的总离子流色谱图参见附录Ａ中图Ａ．１。６．３．３ 定性确证对标准溶液及样液均按上述规定的条件进行检查，如果样液与标准溶液在相同的保留时间有峰出现，则对其进行质谱确证，在扣除背景后的样品谱图中，所选择离子全部出现，同时所选择的离子的离子丰度比与标准品相关离子的相对丰度一致，波动范围符合表１的最大容许偏差范围，可判定样品中存在腈菌唑。腈菌唑标准品的总离子流图和质谱图参见附录Ａ。表１ 定性测定时相对离子丰度最大容许偏差相对离子丰度（基峰）／％＞５０＞２０～５０＞１０～２０≤１０允许的相对偏差／％±２０±２５±３０±５０６．３．４ 空白试验除不加试样外，均按上述检测步骤进行。７ 结果计算和表述样品中腈菌唑的残留量可由ＧＣＭＳＤ数据处理软件按外标法自动计算，也可按式（１）计算：犡＝犃×犮ｓ×犞犃ｓ×犿…………………………（１） 式中：犡———试样中腈菌唑残留量，单位为毫克每千克（ｍｇ／ｋｇ）；犃———样液中腈菌唑的峰面积（或峰高）；犃ｓ———标准工作液中腈菌唑定量离子色谱峰的峰面积（或峰高）；犮ｓ———标准工作液中腈菌唑的浓度，单位为微克每毫升（μｇ／ｍＬ）；犞———最终样液定容体积，单位为毫升（ｍＬ）；犿———最终样液所代表的试样量，单位为克（ｇ）。注：计算结果应扣除空白值。８ 测定低限、回收率、精密度８．１ 测定低限本方法腈菌唑的测定低限为０．００５ｍｇ／ｋｇ。８．２ 回收率采用本方法对样品进行添加回收实验，添加浓度为０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０１０ｍｇ／ｋｇ和０．０２０ｍｇ／ｋｇ，添加回收率见表２。表２ 腈菌唑在样品中的添加浓度及回收率范围（％）（狀＝７）样品名称添加浓度／（ｍｇ／ｋｇ）０．００５０．０１００．０２０大米６２．７～８７．５６８．４～９２．４７０．１～９７．３小米６２．８～７１．２６３．５～７８．２７０．１～９２．１玉米６６．４～７５．１７０．５～９３．４８０．４～９７．０４犛犖／犜２３２１—２００９食品伙伴网表２（续）样品名称添加浓度／（ｍｇ／ｋｇ）０．００５０．０１００．０２０豆类７０．４～７９．５６６．６～８８．４７５．０～９３．２红茶６１．２～７７．０６６．８～７５．１６９．９～９２．２绿茶６６．１～７６．２６９．５～９２．８７８．４～１０３．２花茶６６．７～９４．３７５．２～８２．９７８．６～１０２．８乌龙茶６１．３～７８．７７４．５～９７．６８２．６～１０１．４大麦茶７４．２～９４．２７８．９～１０３．３７６．５～１１６．２花生６６．２～８７．２８６．１～１１２．３８８．４～１１６．１榛子６６．１～１０４．２６８．５～１１１．０８８．７～１１２．６草莓６２．５～９３．４７７．４～１０７．８８８．７～１１６．３苹果６６．４～９９．９７０．５～１０１．８８９．６～１１６．３梨６６．８～９２．５７０．０～９８．１８７．４～１０５．３小白菜６４．２～８５．０６６．６～９８．２８８．４～１００．２黄瓜６２．５～７６．１６９．９～８４．７８７．５～１０６．８辣椒６６．２～８８．１７０．５～９２．１８８．８～１１０．２胡萝卜６８．０～８